Cryoprotection facilitée par l’aptamère des virus

Cryoprotection des vecteurs viraux |

est essentiel pour le développement de vaccins et de traitements anticancéreux.

En raison de la sensibilité à la température, de nombreux virus doivent être stockés

congelé.1 Par conséquent, la livraison de

virus dépend d’une chaîne du froid, un réseau de distribution mis en place pour

maintenir des températures basses optimales pendant le transport et le stockage.

Cependant, ce système de chaîne du froid représente un important volet économique et logistique

le fardeau, estimé à 80% du coût financier total.2 De plus, un vecteur viral devrait être infectieux

en présence des anticorps neutralisants de l’hôte (nAbs).

Dans le travail, nous avons utilisé le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) comme un important

vecteur viral dans les immunothérapies oncolytiques ciblées.3 Il s’agit d’un rhabdovirus à ARN enveloppé constitué d’un lipide.

enveloppe entourant une nucléocapside et une matrice associée formée

par M proteins.4 − 6 VSV est inoffensif et conçu pour cibler malin

cellules et augmentent également la susceptibilité de la tumeur à la chimiothérapie

les agents et la réponse immunitaire de l’hôte. En outre, VSV est un approprié

choix pour les vecteurs vaccinaux et a également un rôle clé dans l’immunité et

recherche en virologie. L’un des défis de l’utilisation de VSV est son

stabilité dans différentes conditions de manipulation et de stockage.7 Plusieurs agents ont été utilisés

la stabilité à basse température des virus en tant que vaccins efficaces tels

comme les ions métalliques, l’albumine et la gélatine.8 − 11 Cependant, aucun de ces composés

ont fourni des résultats satisfaisants pour les virus oncolytiques en raison de

puissance de cryoprotection ou toxicité cellulaire élevée. L’effet stabilisateur

des glycoprotéines sur la surface VSV12 inspiré

nous de regarder les aptamères spécifiques au VSV. Le but de cette étude était de

déterminer si les aptamères peuvent préserver l’infectiosité du VSV après

cycles de décongélation multiples et en présence de nAbs (Schéma 1). Schéma 1 d’un Quadramer et de BridgeResults et discussionNous avons utilisé anti-VSV

Les clones d’aptamères d’ADN Z23, Z29, S39 et M50 (Tableau 1) qui ont été précédemment sélectionnés dans notre laboratoire et ont

montré haute affinité pour VSV.13 Pour augmenter

l’avidité et la stabilité du sérum, nous avons conçu un quadramer, qui a été fait

en reliant quatre aptamères (mélange équimolaire de tous les

aptamères), avec un pont oligonucléotidique (Figure 11 et Schéma 1).

constante de dissociation (Kd) pour monomère

pool et quadramer en utilisant l’approche décrite par Sefah et al.14 Le Kd pour monomère

pool de quatre clones était 71 ± 15 nM, et quadramer avait une affinité

de 22 ± 9 nM. Le rôle protecteur des aptamères et des quadramères

dans l’activité virale a été évaluée en utilisant la plaque-formant et le virus

tests d’agrégation après congélation – cycles de décongélation.Figure 1 Représentation schématique

de liaison virus de la stomatite vésiculaire (VSV) avec un aptamère et un

quadramer. Le pont oligonucléotidique médie la formation du

Quadramer.Table 1Aptamer séquences, où F est CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG et cR est

GCA TAG GTA GTC CAG AAG CCWe a étudié l’effet de dosage

d’un pool équimolaire des clones aptamères et des quadramères sur la stabilité du VSV

après 30 cycles de congélation – Expériences d’effet de dosage indiquées

que l’augmentation de la concentration de la piscine à la fois des aptamères et des quadramères

au-dessus de 400 pM infectiosité améliorée du VSV (Figure ​ (Figure2) .2). Nous avons également étudié l’effet du nombre de congeler – dégel

cycles sur l’infectivité du VSV (54 × 105

unités, PFU) avec le pool d’aptamères (1 μ M), quadramer (0.25 μ M),

et la bibliothèque d’ADN non spécifique (1 μ M) et comparé ceux-ci avec le

virus pur seulement. A cette fin, les trois groupes VSV ont été soumis

à 0, 10, 20, 30, 40, 50 et 60 cycles de congélation et de congélation en double

(Figure ​ (Figure3) .3). L’infectivité de quadramer et

le virus aptamérisé par le pool était supérieur de 1,4 et 0,7 log, respectivement,

que le virus pur après 60 cycles de congélation et de congélation. Fascinant,

il suffit d’ajouter des quadramères au virus sans geler (0e cycle) a augmenté

l’infectivité virale de 30% (figure ​

ce qui peut être attribué à la capacité des quadramères à prévenir le virus

Agrégation.Figure 2 (A) La formation de la peste lorsque les cellules Vero ont été infectés avec

VSV codant pour YFP. (B) Évaluation de l’effet du dosage. Nombre de plaques formées

par VSV traité avec différentes concentrations d’un mélange équimolaire

de l’aptamère (a) et du quadramer (b), tous deux après 30 congélation –

cycles. … Figure 3VSV courbe de corrélation d’infectivité pour la bibliothèque d’ADN

(a), virus pur (b), avec un pool d’aptamères (c), et avec le quadramer

(d) en fonction du nombre de cycles de congélation et de congélation. L’encart

représente l’infectiosité initiale avant tout gel et décongélation … L’effet stabilisateur des aptamères

a été confirmée par électrophorèse capillaire quantitative virale (virale

qCE), 15 où les particules virales intactes

ont été séparés de l’ARN libre libéré pendant la dégradation du virus (Figure 4) (Figure 4) après un cycle de congélation. Les zones

correspondant aux particules de virus intactes ont ensuite été calculées et

affiché dans un graphique à barres (Figure ​ (Figure4B) .4B). De

les électrophérogrammes, les zones de pics de virus montrent que le traitement

VSV avec quadramers protège environ 3 fois plus efficacement que le

virus non traités. Figure 4 (A) Electrophérogrammes pour VSV séparés par électrophorèse capillaire

et détecté par fluorescence induite par laser. VSV a été coloré avec YOYO-1

colorant. Les séparations CE ont été réalisées dans un capillaire de 60 cm de long sous

250 V cm – 1 dans 25 mM de tampon borax à … L’effet des quadramères et du pool d’aptamères sur l’agrégation du VSV in vitro a également été évalué en utilisant un mélange de virus codant

protéine fluorescente jaune (YFP) et protéine fluorescente rouge (RFP)

et en détectant l’expression des protéines fluorescentes correspondantes

dans des cellules Vero (figure ​ (figure 5A) .5A). Agrégation du virus

particules ont été observées lorsque YFP et RFP ont été exprimés dans le

mêmes cellules. Des signaux YFP et RFP se chevauchant ont été détectés dans 27 ±

2,1%, 16 ± 1,9% et 11 ± 1,4% des cellules infectées par de la

virus, traité par aptamère et quadramère, après un cycle

de congélation – décongélation, respectivement. Les résultats montrent relativement

faible agrégation présentée dans VSV traité par quadramère (Figure ​ (Figure5B) .5B). Ceux-ci peuvent être expliqués par la répulsion du virus

particules les unes des autres après la liaison à l’ADN chargé négativement

aptamers. Les aptamères empêchent l’interaction des protéines de surface et

Gardez les particules de virus en suspension dans la solution. Il a été précédemment signalé

que le traitement du VSV avec de la trypsine afin d’enlever la partie collante

de la glycoprotéine conduit aussi à une diminution de l’agrégation virale.16,17 Fait intéressant à noter, le revêtement à base d’aptamères ne supprime pas

la capacité du virus à infecter les cellules en raison de la non-covalente et réversible

nature de l’interaction aptamère avec le virus.Figure 5Cellules infectées par un virus

mélange constitué de quantités égales de VSV codant YFP et RFP. (UNE)

Imagerie fluorescente de YFP et RFP dans des cellules Vero après 24 h de virus

infection; (B) pourcentage de cellules exprimant YFP, RFP, et les deux après

infection par VSV pur … vecteurs viraux ’

la survie et l’infectivité en présence de nAbs sont des facteurs importants

pour l’efficacité du vaccin. Par conséquent, en plus de la cryoprotection,

nous avons évalué la compétence aptamère et quadramer pour protéger VSV de

anticorps neutralisants. Nous avons mesuré l’infectiosité du VSV après

incubation avec le pool d’aptamères (1 μ M) et quadramer (0,25

μ M) ainsi que des groupes témoins en présence de sérum de lapin

contenant des nAbs sur des cellules Vero. Alors que les nAbs neutralisaient l’infectivité virale,

VSV incubée avec pool d’aptamères et quadramer récupéré les infectivités

d’environ 25% et 75%, respectivement (figure ​ (figure 6) .6). Afin de vérifier la toxicité in vivo, 400 μ g

à la fois le pool d’aptamères seul et le quadramer avec VSV ont été administrés par voie intraveineuse

administré (i.v.) par la veine de la queue deux fois (jour 1 et jour

2) en trois souris mâles BL6 (âgées de 10 semaines) en deux groupes, selon

Ils ont été examinés pour les symptômes externes de la toxicité.

pendant 5 jours après l’administration. Les souris n’ont pas développé de diarrhée,

léthargie, la fourrure à volants, perte d’appétit, ou perdre du poids.Figure 6Comparison

des efficacités d’un mélange équimolaire d’aptamères et de quadramer

pour protéger l’infectiosité du VSV en présence d’anticorps neutralisant le VSV. Conclusion: nous avons

aptamères anti-VSV modifiés en les reliant entre eux pour former des tétramères

homologues et ont été en mesure d’atteindre une augmentation de 1,4 log du virus

infectiosité après 60 cycles de congélation et de décongélation dans une formation de plaque

essai. L’ajout de ces aptamères au VSV empêche l’agrégation virale et

protège son infectiosité contre les anticorps neutralisants. Les résultats

de cette étude a ouvert de nouvelles portes aux applications aptamères

et des protecteurs d’anticorps. Ces types d’aptamères peuvent potentiellement être

appliqué in vivo, en combinaison avec l’oncolytique

virus, pour empêcher l’élimination du virus et ainsi augmenter son oncolyse

Efficacité sans effet toxique.