Les inhibiteurs HDAC6 puissants et sélectifs basés sur les thiols favorisent l’acétylation de la tubuline et la fonction suppressive des cellules régulatrices de la T

Modifications post-traductionnelles

des histones, les protéines autour de laquelle l’ADN est enveloppé, jouent un rôle clé

rôle dans la régulation de la structure de la chromatine et ainsi contrôler biologique

des événements tels que l’expression génique et la réparation de l’ADN. Les modifications covalentes

qui se produisent sur les queues d’histone comprennent l’acétylation, la méthylation, l’ubiquitinylation,

phosphorylation, sumoylation, et ADP ribosylation.1 Ces modifications épigénétiques ont conduit à

intérêt pour la découverte de petites molécules capables de moduler la

enzymes responsables. Nous sommes intéressés par l’acétylation des histones et

désacétylation, qui sont des processus réversibles régulés par histone / protéine

les acétyltransférases (HAT) et les histones / protéines désacétylases (HDAC) .2 Les HDAC sont une famille de 11 enzymes zinc-dépendantes

qui sont divisés en 4 groupes. La classe I comprend les HDAC 1, 2, 3 et

8; la classe IIa comprend les HDAC 4, 5, 7 et 9; la classe IIb comprend les HDAC

6 et 10; et la classe IV ne contient que des HDAC 11.3 HDAC qui éliminent spécifiquement les groupes acétyle des résidus de lysine

protéines cibles, régulant ainsi leur fonction. Acétylation de la lysine

est impliqué dans de nombreux processus cellulaires, tels que la régulation du cycle cellulaire,

dynamique du cytosquelette et la motilité cellulaire.

centré ces dernières années sur les rôles importants que jouent les

la cancérogenèse, y compris la régulation de l’expression des gènes impliqués

dans la prolifération cellulaire, la régulation du cycle cellulaire et l’apoptose.4 − 6 Plusieurs HDAC sont surexprimés dans divers types de tumeurs,

les valider comme cibles thérapeutiques importantes.4,5

Outre leur application en oncologie, les inhibiteurs de l’histone désacétylase

(HDACI) peuvent présenter des effets neuroprotecteurs chez les animaux et les animaux

modèles de lésions et de maladies neurodégénératives aiguës et chroniques, 7,8 incluant les lésions cérébrales traumatiques, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies d’Alzheimer

maladie (AD). De plus, l’acide valproïque, un inhibiteur faible de l’HDAC, est

largement utilisé cliniquement dans le contrôle du trouble bipolaire et de l’épilepsie.9 Actuellement, plus de 20 HDACI sont entrés

des études cliniques, et plusieurs sont déjà sur le marché. Le dernier

inclure un dérivé de l’acide hydroxamique, l’acide suberoylanilide hydroxamique

(SAHA, vorinostat, Zolinza), et un depsipeptide, FK228 (romidepsine,

Istodax), qui ont été approuvés pour le traitement des cellules T cutanées

lymphome; chidamide (Epidaza) qui a été développé en Chine pour être utilisé

dans le lymphome T réfractaire périphérique; et LBH-589 (panobinostat,

Farydak), qui a été récemment approuvé pour une utilisation chez les patients

myélome. En outre, ACY-1215 (ricolinostat) est un HDAC6 sélectif

inhibiteur en cours d’évaluation dans les essais cliniques (Figure ​ Figure11) .10,11Figure 1Structures

de plusieurs pan-HDACI et ricolinostat connus, un inhibiteur sélectif de HDAC6

dans les essais cliniques. En raison de cette clinique

potentiel, la conception de nouveaux HDACI continue d’attirer l’intérêt

de chimistes médicinaux. Le pharmacophore d’un HDACI typique implique

un groupe de coiffe qui interagit avec la surface de l’enzyme, un lieur

qui occupe un canal hydrophobe, et un chélateur de métal qui coordonne

avec l’ion zinc au fond de la poche catalytique.12,13 De nombreuses HDACI de première génération, comme SAHA, sont paninhibitoires, c’est-à-dire,

ils ont peu, voire pas, de sélectivité isoforme. De plus, beaucoup

Les HDACI, tels que la trichostatine A (TSA, figure &#x200B, figure 11) et SAHA, contiennent une fonction acide hydroxamique

en tant que groupe liant le zinc (ZBG). Malheureusement, les hydroxamates sont métaboliquement

instable (SAHA a une demi-vie de 1,5 – 2 h chez l’homme lorsqu’il est administré

par voie orale), et leur puissante capacité de chélation des métaux peut conduire à la non-cible

d’autres enzymes contenant du zinc.14,15 De plus, de nombreux inhibiteurs à base d’acide hydroxamique ont été

être Ames-positif et de provoquer des aberrations chromosomiques, liant ainsi

En conséquence, d’autres ZBG, telles que les mercaptoacétamides, peuvent être

préférable, en fonction de l’objectif thérapeutique.17,18 Certes, l’application d’un HDACI aux troubles chroniques tels

comme certaines maladies du SNC nécessiteraient que le composé ne provoque pas

génotoxicité.En plus de leurs effets sur les histones, de

Les HDAC, y compris HDAC6, agissent sur les protéines non histones. Ainsi, HDAC6 participe

dans la désacétylation de α -tubuline, cortactine et HSP90, et

régule ainsi les processus biologiques importants, y compris les microtubules

la stabilité et la fonction, et la motilité cellulaire.19 HDAC6 est apparue comme une cible attrayante pour le développement de médicaments,

comme son inhibition est censée offrir une thérapie potentielle pour le cancer

et de nombreuses affections neurodégénératives, y compris les lésions de la moelle épinière20. Seuls quelques inhibiteurs HDAC6 hautement sélectifs

ont été signalés à ce jour. Par exemple, le tubacin (Figure ​ Figure 11) a été développé sur 10 ans

il a été largement utilisé dans divers modèles de maladies pour valider

HDAC6 en tant que cible thérapeutique.21 Cependant,

sa lipophilie élevée et sa synthèse fastidieuse limitent son utilisation comme médicament.

Pour cette raison, nous avons développé la tubastatine A (figure ​ figure 11), un HDAC6 à base d’acide hydroxamique plus puissant.

inhibiteur.22 Malgré le fait que ces

les petites molécules sont d’un grand intérêt en tant qu’outils chimiques pour le sondage

la fonction biologique de HDAC6,22,23 il est maintenant

clair que, afin de minimiser les effets secondaires indésirables, il y a

un besoin d’identifier les inhibiteurs sélectifs des isoformes

exempt de certains problèmes de sécurité associés à la classe des hydroxamates

des HDACI12. Dans ce contexte,

nous avons jugé utile d’approfondir la puissance, l’isoforme

la sélectivité et les effets biologiques d’autres produits à base de mercaptoacétamide

les inhibiteurs. Nous et d’autres ont déjà fait rapport sur le mercaptoacétamide

HDACI qui présentent une sélectivité HDAC6 combinée avec des thérapeutiques prometteuses

comparés à leurs analogues respectifs de l’acide hydroxamique.7,24 En particulier, le composé 1 (figure ​ figure 22) a été trouvé pour réguler les niveaux de surface cellulaire

de la protéine précurseur amyloïde (APP) et de moduler les niveaux

de A β synthèse et A β enzymes de dégradation. A β peptides

sont des produits neurotoxiques, principalement liés à la MA, qui sont libérés

le clivage de APP par β – et γ -secretases. Souris AD traitées

avec le composé 1 avait diminué le cerveau A β les niveaux,

diminution de la phosphorylation de la tau et amélioration de l’apprentissage et de la mémoire24. De plus, un mercaptoacétamide

trouvé pour diminuer la réponse inflammatoire dans le cerveau des animaux

soumis à une lésion cérébrale traumatique. 25 Figure 2: à base de mercaptoacétamide

HDACI présentés dans ce travail, contenant 8-aminoquinoline et 1,2,3,4-tétrahydroquinoline

comme les groupes de casquette.Un inconvénient possible

des HDACI contenant des thiols est leur capacité à subir une dimérisation oxydative

pour former des disulfures. Ainsi, le taux de dimérisation de la base thiol

les composés doivent être pris en compte lors du profilage de l’activité de ces

inhibiteurs contre les protéines HDAC purifiées. Il est en outre possible

que la liaison disulfure d’un HDACI oxydé pourrait être réduite par le

des niveaux élevés de glutathion présents à l’intérieur des cellules pour restaurer la

parent thiol.Given ces considérations, nous avons effectué des

chimie et biologie des mercaptoacétamides structurellement liés à

composé 1 (Figure ​ Figure 22) cardiomyopathie. Nous décrivons ici la synthèse, inhibiteur HDAC

puissance, et la sélectivité de ces composés.Tous les nouveaux ligands

préparé contient quatre à sept unités CH2 dans l’éditeur de liens

région, car cela semble être la longueur optimale pour les petites molécules

pour entrer dans la poche de liaison de HDAC6.26 Le choix des groupes de coiffe était basé sur la structure du composé 1 (Figure ​ Figure 22) et d’autres HDACI précédemment explorées par nous. Les mercaptoacétamides 2a – c ont été synthétisés à partir de à partir d’amino-alcools N-protégés de longueurs variables (5a – c, Schéma 1). Leur conversion en halogénures d’alkyle correspondants

(6a – c) a eu lieu dans des conditions douces

en présence de triphénylphosphine (PPh3) et de tétrabromométhane

(CBr4). La 8-aminoquinoléine a été alkylée avec 6a – c sous irradiation micro-ondes (μ W)

donner les intermédiaires 7a – c, respectivement.

Les groupes protecteurs Boc ont été éliminés avec de l’acide trifluoroacétique (TFA),

puis les amines libres ont été soumis à une réaction de couplage avec

Acide 2- (tritylthio) acétique en présence de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium

hexafluorophosphate (PyBOP). Enlèvement des groupes protecteurs trityles

en présence de TFA et de triéthylsilane (Et3SiH)

les mercaptoacétamides finaux 2a – c.Schéma 1Synthèse des composés 2a – c et 3a, bLe mercaptoacétamide 3a, contenant un bouchon de tétrahydroquinoline (THQ), a été obtenu par couplage

de l’acide N-Boc-7-aminoheptanoïque (10, schéma 1) avec du chlorhydrate de N, O-diméthylhydroxylamine pour donner

Weinreb amide 11, qui a été réduit en aldéhyde 12 avec LiAlH4. Par la suite, l’amination réductrice

de l’intermédiaire 12 avec le bouchon THQ obtenu 13. Ensuite, déprotection Boc, formation d’amide en présence de PyBOP,

et l’élimination du groupe trityle a donné du mercaptoacétamide 3a. Le composé 3b a été synthétisé par couplage.

de la coiffe THQ avec N-Boc-6-aminohexanoïque

acide (16). L’amide résultant a ensuite été prélevé

les mêmes trois dernières étapes décrites ci-dessus pour l’analogue 3a. Le même trajet de synthèse utilisé pour le composé 3a conduit à l’analogue 3c, introduisant la 6-chloro-1,2,3,4-tétrahydroquinoline.

noyau 2 dans l’étape d’amination réductrice de coiffe-lieur (schéma 2) .Synthèse 2Synthèse des composés 3c et 4To synthétisent le composé 4, acide 4 – [((tert-butoxycarbonyl) amino) méthyl] benzoïque (25, schéma 2) et 8-aminoquinoléine

ont réagi en présence de 1-éthyl-3- (3- (diméthylamino) propyl) carbodiimide

(EDC) et 4-diméthylaminopyridine (DMAP). La N-déprotection finale, le couplage d’amide et la S-déprotection

étapes ont été effectuées comme décrit précédemment.Avec le désiré

composés en main, nous avons ensuite dosé l’activité de chacun à HDAC1 et

HDAC6 en utilisant un test basé sur la fluorescence. Les valeurs IC50 étaient

déterminé en double. Les résultats sont listés dans le tableau 1. La TSA et le composé 1 ont été utilisés

comme contrôles positifs. En évaluant les effets inhibiteurs HDAC de

composés 2 – 4, les dosages ont été effectués

en présence de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP),

la procédure décrite par Baud et ses collègues (voir les détails dans les renseignements à l’appui) .27 Ainsi, le PTCE a été ajouté à des solutions mères de mercaptoacétamides 2 – 4 afin d’éviter la dimérisation de

ces composés lorsqu’ils sont dilués dans du DMSO et de l’eau.Table 1HDAC Inhibitory Activity of MercaptoacetamidesaPrior SAR études ont suggéré que la longueur de la chaîne

pour les inhibiteurs HDAC6 est optimale lorsque n = 2 ou 3 (Figure ​ Figure 22) .26 Nos résultats corroborent ces résultats, et suggèrent aussi

que les composés avec une chaîne alkyle plus courte, n = 1,

peut encore présenter une très bonne activité (2a, HDAC6 IC50 = 7,9 nM). Auparavant, notre recherche avait déterminé

qu’un linker benzyle était optimal pour l’hydroxamique sélectif HDAC6 puissant

dérivés de l’acide23. Ayant cela à l’esprit,

nous avons exploré un lieur aromatique avec le mercaptoacétamide

ZBG; cependant, l’analogue 4 présentait une très faible activité.

Ce résultat indique que bien que le linker benzyle soit approprié

pour les acides hydroxamiques, cela peut ne pas être le cas pour les thiols. Bien sûr,

cette comparaison n’est pas entièrement précise, comme la longueur de l’éditeur de liens

la région du composé 4 est plus grande que celle du lieur

région trouvée dans la tubastatine A.Both THQ et 8-aminoquinoline

caps ont généré des analogues puissants et sélectifs, à l’exception

de 3c, mais il est important de noter que le bouchon THQ est

plus lipophile, suggérant que les composés tels que 3a (cLogP = 4,21) sont plus susceptibles de pénétrer dans le cerveau

barrière pour le traitement des maladies du SNC. D’un autre côté, remplacer

la coiffe aminoquinoline dans le composé 2c (n = 3) avec le bouchon THQ pour arriver au composé 3a (n = 3) a entraîné une légère diminution de la puissance. Cette différence

en puissance peut refléter la capacité de la coiffe de 8-aminoquinoléine à

établir une interaction de liaison hydrogène supplémentaire avec la surface

de l’enzyme, due à la présence d’un second atome d’azote.Une diminution de la puissance est observée lorsque le lieur amide du composé 1 est remplacé par une amine secondaire comme dans le composé 2c, bien que le même motif ne soit pas conservé pour les composés

avec une chaîne alkyle plus courte (2a et 2b). Pour évaluer la sélectivité HDAC6 dans un contexte plus biologiquement pertinent,

nous avons étudié l’aptitude des composés 1, 2a, 2b et 3a à induire l’acétylation de la β-tubuline,

le substrat primaire de HDAC6, dans les neurones. Concentrations micromolaires faibles

des composés d’essai appliqués aux cultures primaires de rat cortical

neurones (E17) ont conduit à une augmentation, dose-dépendante, de la tubuline acétylée α

(AcTub) niveaux. En accord avec une inhibition sélective de HDAC6, le

les mêmes concentrations de composés n’augmentent pas l’acétylation

les niveaux d’histone H3, qui est une cible des HDAC de classe I (Figure ​ Figure 33). Tous les composés testés

acétylation de tubuline induite à 10 μ M ou moins, avec le composé 2b montrant la plus grande efficacité (plus de 10 fois l’induction

d’AcTub à 1 μ M). Les résultats à 10 μ M sont comparables

à celles obtenues avec les HDACI contenant de l’hydroxamate

A (TubA) et la trichostatine A (TSA), qui ont été utilisés comme témoins positifs.

À 1 μ M, TubA et TSA sont significativement plus puissants que le

composés présents. Le composé 1 produit une induction 5 fois

de l’acétylation de la tubuline à 1 μ M, alors que 2a et 3a ont eu une activité plus faible à la même concentration.Figure 3 (a) Western

des buvardages de tubuline acétylée par rapport à la tubuline

neurones corticaux. Les cultures corticales primaires de rat (E17) ont été traitées

avec la TSA, la tubastatine A ou les analogues de thiols 1, 2a, b et 3a pendant 6 h à

concentrations, … La modulation pharmacologique

de la suppression T-régulatrice (Treg) est considérée comme une possible

approche pour ralentir ou inverser la pathogenèse des maladies auto-immunes

comme la maladie inflammatoire de l’intestin et la polyarthrite rhumatoïde, et

prévenir le rejet d’allogreffe. Inhibition pharmacologique de HDAC6, en utilisant

les composés à base d’hydroxamate tels que la tubastatine A et ses analogues,

Il a été démontré précédemment que les cellules suppressives murines23,28 et humaines29 Foxp3 + augmentent les fonctions suppressives.Pour examiner si les présents composés pourraient avoir un effet anti-inflammatoire

l’action, ils ont été testés pour leur capacité à améliorer l’immunosuppresseur

fonction des cellules Foxp3 + Treg murines in vitro. Ainsi,

ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE)

Les cellules effectrices T (Teff) ont été incubées en présence et en absence

de Tregs, avec ou sans addition d’inhibiteurs de HDAC6 sélectionnés

à des concentrations multiples. En utilisant les thiols rapportés ici à 1

μ M, des effets variables ont été observés. Les effets directs des composés

sur la prolifération des cellules Teff dans ces essais ne sont pas vus, comme indiqué

par prolifération cellulaire Teff comparable en l’absence de cellules Treg

(Treg: rapport Teff de 0: 1). Comparé aux cellules correspondantes exposées à

DMSO seul, tous les sept composés, à savoir 2a – c, 3a – c, et 4, la fonction Treg accrue, ce qui entraîne une diminution de la prolifération des cellules Teff

au rapport Treg: Teff 1: 1, mais seulement trois composés, à savoir 2a – c, étaient également efficaces au Treg 1: 2: Teff

ratio, et seul le composé 2b était également efficace au

1: 4 Treg: rapport Teff (Figure ​ Figure 44) .Figure 4Effets des composés thiols (1 μ M) sur les suppresseurs Treg murins

fonctions in vitro. Prolifération cellulaire CFSE + Teff résiduelle

est montré à chaque rapport de Treg: cellule de Teff; les tests ont été effectués dans

tripliquer et répéter au moins une fois; signifie ± SD … Nous avons développé une petite série de mercaptoacétamides, dont deux

présente un seul digit nM HDAC6 IC50s. En particulier, le composé 2b induit une augmentation, dose-dépendante, de la ß-tubuline acétylée.

dans les neurones corticaux primaires, apparente à 0,5 μ M, et sans

effet significatif sur l’acétylation de l’histone H3. Certains de ces composés

ont également été trouvés pour améliorer la suppression de Treg de la prolifération de Teff in vitro. Parce qu’il n’y a pas d’antécédents de mercaptoacétamides

étant liés à la génotoxicité, les résultats trouvés ici suggèrent que

ces composés devraient être explorés plus loin en ce qui concerne la thérapie

dans le cancer et dans les maladies inflammatoires et dégénératives, dans lequel

l’usage prolongé de drogues sera exigé. Des efforts supplémentaires pour générer des analogues

avec une meilleure pénétration du sang – la barrière du cerveau sont en cours

faite afin d’évaluer ces composés dans divers modèles animaux

des maladies neurodégénératives, et l’efficacité de ces composés

dans les modèles d’auto-immunité et de rejet de greffe seront rapportés

dans les études futures.