Tests d’amplification des acides nucléiques pour le diagnostic de la pneumonie

Les techniques de diagnostic moléculaire, comme la PCR, sont des outils prometteurs pour le diagnostic étiologique rapide de la pneumonie viagra-danmark.net. La PCR offre des avantages potentiels par rapport aux tests conventionnels de détection de Mycoplasma pneumoniae, Legionella species et Chlamydia pneumoniae Pour la pneumonie pneumococcique chez l’adulte, la PCR apporte peu Bien que la PCR soit probablement plus sensible que les méthodes conventionnelles de microscopie pour le diagnostic de la pneumonie à Pneumocystis carinii, la spécificité est incertaine, parce que P carinii peut être occasionnellement détecté dans les tests diagnostiques existants et est incapable de distinguer la colonisation pneumococcique de l’infection. Absence de symptômes cliniques La PCR est utile pour le diagnostic de la pneumonie virale chez les patients immunodéprimés. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour mieux caractériser le rôle de la PCR par rapport au rôle des autres tests diagnostiques de la pneumonie. stic laboratories

La pneumonie est l’une des maladies infectieuses les plus courantes chez les adultes et les enfants Malgré les avancées récentes dans les tests diagnostiques, le diagnostic étiologique de la pneumonie est rarement réalisé avec confiance Même dans les études les plus rigoureuses, il est difficile d’établir un diagnostic étiologique. pneumonie acquise dans la communauté Dans le monde réel, le taux de diagnostic est beaucoup plus faible. Cela a conduit certains chercheurs à s’interroger sur l’utilité d’effectuer systématiquement des tests microbiologiques chez les patients atteints de pneumonie Bien qu’il puisse être justifié de ne pas ordonner systématiquement des tests microbiologiques Les progrès les plus prometteurs ont été réalisés avec les tests de détection des antigènes et des acides nucléiques Les nouveaux tests de détection des antigènes urinaires immunochromatographiques pour Legionella pneumophila et Streptococcus pneumoniae sont faciles et rapides à réaliser hautes sensibilités et sp De plus, avec d’autres améliorations et développements, on s’attend à ce que de nombreux autres tests de détection d’antigènes pour les agents pathogènes de la pneumonie soient disponibles dans le commerce. Ces dix dernières années, les techniques d’amplification des acides nucléiques ont été largement évaluées. pneumonie Bien qu’aucun de ces tests ne soit facilement disponible ou utilisé de façon routinière, on s’attend à ce que la situation change au cours des prochaines années. Cette revue se concentre sur le rôle actuel des techniques de diagnostic moléculaire pour déterminer l’étiologie de la pneumonie. , car il s’agit de la méthode d’amplification de l’acide nucléique presque exclusivement évaluée dans des études publiées La détection des mycobactéries pulmonaires ne sera pas discutée car cela a fait l’objet de révisions récentes

Techniques de diagnostic moléculaire pour la pneumonie

La PCR est un outil attrayant pour diagnostiquer la cause de la pneumonie, car elle peut détecter des quantités infimes d’acide nucléique de potentiellement tous les agents pathogènes de la pneumonie, ne dépend pas de la viabilité du microbe cible, est probablement moins affectée par la thérapie antimicrobienne antérieure. En outre, une mécanisation accrue signifie que la PCR est de plus en plus disponible pour les laboratoires en dehors des centres de référence tertiaires spécialisés. Le développement de la technologie PCR en temps réel permet d’effectuer des tests dans & lt; h dans un seul récipient de réaction, réduisant ainsi le risque de contamination. Ces avantages peuvent faire de la PCR le test de diagnostic idéal pour la pneumonie , bien qu’il y ait quelques inconvénients à s’appuyer sur des approches moléculaires plutôt que sur la culture. capacité à effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens et l’absence d’archive d’isolats si des tests futurs sont requisPas encore, aucun test PCR n’a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis pour le diagnostic de pneumonie, bien que des tests commerciaux soient disponibles. protocoles doivent être établis Plusieurs paramètres clés doivent être déterminés avant que la PCR ne devienne une partie du diagnostic de routine pour un pathogène particulier de la pneumonie, notamment la sensibilité et la spécificité, la reproductibilité et les types d’échantillons optimaux

Sensibilité et spécificité

Le calcul précis de la sensibilité clinique pour un test PCR est entravé par l’absence d’un «gold standard» diagnostique approprié pour la plupart des infections. Il s’agit d’un problème inhérent à la PCR, qui est probablement plus sensible que la plupart des diagnostics tests La sensibilité peut être affectée par la présence dans les échantillons d’inhibiteurs de PCR, généralement inconnus, qui provoquent des résultats faussement négatifs Ces inhibiteurs peuvent être détectés par l’inclusion de contrôles internes positifs spécifiques, qui devraient faire partie de chaque PCR. dosage Compte tenu des faibles volumes de mélanges réactionnels de PCR, les erreurs d’échantillonnage peuvent également réduire la sensibilité, ce qui peut être amélioré en augmentant le volume d’échantillon dans le mélange réactionnel ou en concentrant l’échantillon.Le risque de résultats faussement positifs est un problème majeur. Ceci est en grande partie une conséquence de l’extrême sensibilité de la PCR et peut résulter d’une contamination par des matériaux exogènes ou de la détection de faibles taux Les résultats faussement positifs peuvent également résulter de l’amplification de micro-organismes ayant des séquences génomiques similaires à celles de l’organisme cible. Les résultats faussement positifs peuvent être évités en utilisant des témoins appropriés, de bonnes pratiques de laboratoire pour prévenir la contamination et confirmation de tous les résultats positifs par une méthode indépendante La séquence d’acide nucléique ciblée de tous les tests de PCR nouvellement développés doit être vérifiée pour la spécificité au moyen d’un outil tel que l’outil Basic Local Alignment Sequence disponible sur: http: // wwwncbinlmnihgov / BLAST / This est un exercice utile même pour des séquences publiées antérieurement pour des tests PCR, car des erreurs dans la publication de séquences d’amorces ont entraîné le transfert de l’erreur aux tests utilisés par d’autres chercheurs Cette recherche peut également identifier des séquences similaires d’autres microorganismes le test a été développé initialement. La sensibilité et la spécificité peuvent également être influencées par le type de P Dosage CR La PCR nichée est généralement plus sensible que la PCR en une seule étape, mais il y a un risque accru de contamination pour la PCR nichée, car les tubes réactionnels doivent être ouverts après la première étape pour ajouter des réactifs pour le second cycle d’amplification. , qui amplifie & gt; La spécificité de la PCR multiplex peut également être réduite si les températures d’hybridation pour les paires d’amorces individuelles ne sont pas identiques. L’utilisation de l’hybridation avec des sondes spécifiques, la fluorescence, ou EIA pour détecter les produits PCR amplifiés assure la spécificité du produit de PCR et peut augmenter la sensibilité, par rapport à la visualisation standard des produits de PCR après électrophorèse sur gel d’agarose

Reproductibilité

Il est essentiel que les protocoles PCR soient suffisamment fiables et robustes pour être utilisés en dehors des laboratoires de recherche. Malheureusement, il est souvent difficile de comparer les résultats de différentes investigations, même lorsque la même cible de PCR est utilisée. Les protocoles peuvent différer en ce qui concerne la préparation des échantillons, la nature des contrôles et les conditions de PCR. Peu de tests ont été évalués indépendamment par des laboratoires externes. Il existe un réel besoin d’approches plus standardisées pour les tests diagnostiques. pneumoniae provoquera une action similaire pour d’autres agents pathogènes de la pneumonie

Types d’échantillons optimaux

Pour la pneumonie, des échantillons respiratoires et non respiratoires ont été utilisés. La plupart des études ont évalué des échantillons des voies respiratoires inférieures, en particulier des échantillons d’expectoration et de lavage broncho-alvéolaire, qui sont susceptibles d’avoir le meilleur rendement diagnostique. l’aspiration à l’aiguille peut avoir un rendement microbiologique encore plus élevé et présenter un risque de contamination plus faible que les autres échantillons des voies respiratoires inférieures , mais cette méthode est peu utilisée. La PCR est particulièrement utile pour la détection de pathogènes non colonisés. les voies respiratoires humaines, telles que les espèces de Legionella, pour lesquelles un résultat positif fournit de solides preuves d’infection Une limitation majeure des échantillons des voies respiratoires inférieures est qu’elles peuvent être difficiles à obtenir Par exemple, moins de la moitié des patients atteints de légionellose produisent des expectorations. , et les procédures invasives, telles que la bronchoscopie, ne Pour certains pathogènes qui ne colonisent pas l’oropharynx, des prélèvements de gorge ou de lavage oral peuvent être utiles et généralement faciles à obtenir. Des pathogènes peuvent également être détectés dans des échantillons de sang total, de sérum, de plasma et de leucocytes périphériques. l’urine, mais l’utilité de chaque type d’échantillon variera en fonction de l’agent pathogène testé et du stade de la maladie. Ces échantillons des voies respiratoires inférieures ont l’avantage de pouvoir être facilement obtenus par tous les patients.

Application de techniques de diagnostic moléculaire pour le diagnostic d’agents pathogènes spécifiques de la pneumonie

Streptococcus pneumoniae S pneumoniae est la cause la plus fréquente de pneumonie communautaire chez les adultes et les enfants Cependant, un diagnostic définitif de pneumonie pneumococcique est difficile à établir au moyen de tests diagnostiques conventionnels La culture sanguine manque de sensibilité et l’isolement de S pneumoniae des échantillons d’expectorations peut représenter une colonisation oropharyngée Les nouveaux tests d’antigènes urinaires pneumococciques sont prometteurs mais peuvent être moins fiables pour les enfants L’utilisation de la PCR comme outil de diagnostic de la pneumonie pneumococcique a été assez largement évaluée chez les adultes et les enfants. de tests de PCR pour d’autres agents pathogènes de pneumonie, qui testent principalement des échantillons respiratoires, la plupart des études de S pneumoniae PCR se sont concentrées sur des échantillons de sang total, sérum ou plasma pour détecter des bactériémies pneumococciques occultes. échantillons obtenus du même groupe de patients Lorsqu’un résultat de hémoculture positive est utilisé comme « étalon-or », diagnostic des sensibilités présentées pour la détection de S pneumoniae dans des échantillons de sang ont été% -% chez les adultes [, -] et% -% chez les enfants Lorsque la La raison de cette variation n’est pas claire, parce que des protocoles de PCR similaires ont été utilisés dans la plupart des études. Des résultats PCR positifs ont également été enregistrés pour le contrôle de la pneumococcie pneumococcique. sujets dans plusieurs de ces études, et ces résultats ne sont pas facilement expliqués

pathogènes, protocoles standardisés à développerChlamydiaspecies L’utilisation de cultures cellulaires pour la détection de C pneumoniae est techniquement exigeante et longue, et les cultures cellulaires ont généralement un faible rendement. En conséquence, le diagnostic d’infection à C pneumoniae repose largement sur des tests sérologiques utilisant microimmunofluorescence Un diagnostic sérologique de l’infection à C. pneumoniae nécessite l’analyse d’échantillons de sérum en phase aiguë et en phase de convalescence; Par conséquent, les résultats des différentes études sont souvent contradictoires et les résultats de certains laboratoires ne sont pas confirmés par d’autres, malgré le fait que les résultats de plusieurs études ne permettent pas de diagnostiquer l’infection à C. pneumoniae. utilisation de protocoles identiques Bien que les prélèvements de tissus vasculaires, les échantillons sériques et les PBMC aient été testés par PCR pour étudier l’association entre C pneumoniae et les maladies cardiovasculaires , les échantillons respiratoires ont été testés presque exclusivement lors de l’étude de la pneumonie. être au moins aussi sensible que la culture, mais la spécificité est difficile à évaluer en raison de l’absence d’un «étalon-or» approprié L’ADN de C pneumoniae peut être détecté dans les échantillons des voies respiratoires supérieures et inférieures, mais on ne sait pas Les chercheurs ont trouvé un taux de positivité PCR plus élevé pour les En effet, l’utilisation de techniques de PCR hautement sensibles peut augmenter la capacité à détecter le portage de C pneumoniae, dont la pertinence clinique n’est pas claire. Une étude utilisant un protocole standardisé a remis en question la fiabilité d’un test de PCR nichée en C pneumoniae en raison du risque élevé de contamination. Les résultats de la PCR doivent être clairement interprétés dans le contexte de la présentation clinique du patient. Les tests de diagnostic de C pneumoniae ont été récemment recommandés par les US Centers for Disease Control Atlanta et le Laboratoire canadien de lutte contre la maladie Ottawa, Ontairio, Canada Des tests PCR ont été développés pour détecter Chlamydia psittaci, bien qu’il y ait expérience de leur utilisation pour le diagnostic de la psittacose humaine Wider u Pneumocystis carinii Pneumocystis jiroveci La méthode standard pour le diagnostic de la pneumonie à P. carinii est la coloration cytologique du lavage broncho-alvéolaire ou des échantillons d’expectorations induites par immunofluorescence ou coloration des tissus, tels que la méthénamine argent, le Giemsa ou le bleu de toluidine. O Plusieurs études ont confirmé que la PCR est plus sensible à la détection de P carinii que les méthodes cytologiques Bien que la spécificité de la PCR soit généralement élevée, plusieurs de ces études ont identifié des échantillons positifs par PCR mais négatifs par des tests standard et / ou Ces résultats sont difficiles à interpréter et peuvent représenter une colonisation de P carinii de pertinence clinique incertaine. Le risque de résultats faussement positifs est plus grand pour la PCR nichée que pour les tests de PCR en une seule étape, en particulier lors des tests. échantillons prélevés sur des patients non infectés par le VIH Les preuves suggèrent que la PCR quantitative peut aider à distinguer la colonisation par P carinii de l’infection , mais cela nécessite une évaluation plus approfondie. Le type d’échantillon préféré pour le test PCR est similaire à celui utilisé pour les cytologies. Dans une série, la sensibilité et la spécificité de la PCR étaient respectivement de% et de% pour les échantillons de lavage bronchoalvéolaire et de% et%, respectivement, pour les échantillons d’expectorations induites, ce qui a incité les auteurs à suggérer que la PCR Les lavages oraux peuvent être un autre échantillon non invasif pour les patients infectés par le VIH avec une charge fongique élevée, bien que la sensibilité de la PCR de ces échantillons soit inférieure à celle des voies respiratoires inférieures. échantillons de tractus [,,,] P carinii ADN peut également être détecté dans des échantillons de sang, bien que la clinique L’utilité est incertaine [,,] Le rôle de la PCR pour le diagnostic de PCP n’a pas encore été établi Contrairement aux tests standard pour d’autres agents pathogènes de la pneumonie, les méthodes cytologiques pour détecter P carinii peuvent être réalisées en même temps ou plus rapidement que la PCR. À l’heure actuelle, la PCR peut être mieux utilisée pour tester des échantillons prélevés chez des patients ayant une forte suspicion clinique de PCP mais pour lesquels les résultats obtenus par les méthodes de dépistage cytologique sont négatifs.

Virus respiratoires

La pneumonie chez un patient infecté par un virus peut être une pneumonie virale primaire ou secondaire à une infection bactérienne. Lorsqu’ils sont systématiquement évalués, les virus représentent ~% des pathogènes identifiés chez les adultes et chez ~% des enfants hospitalisés pour pneumonie communautaire Le virus respiratoire syncytial, les virus grippaux A et B, les virus parainfluenza et les adénovirus étant numériquement les plus importants Actuellement, les méthodes d’immunofluorescence, de culture virale et de détection d’antigène sont les plus utilisées pour le diagnostic en laboratoire des infections respiratoires virales. pour tous les virus respiratoires importants Un test PCR multiplex commercial pour les virus respiratoires a été développé , mais il n’a pas encore reçu l’approbation de la Food and Drug Administration américaine. À ce stade, le rôle de la PCR pour le diagnostic de pneumonie reste incertain , parce que la plupart des études se sont concentrées sur une infection des voies respiratoires mal définie ou non En particulier, chez les enfants, la PCR est susceptible d’améliorer la capacité à diagnostiquer la pneumonie virale, mais les études de patients atteints de pneumonie bien définie sont nécessaires. Actuellement, les principales applications cliniques de la PCR sont le diagnostic de pneumonies virales spécifiques. Par exemple, le syndrome pulmonaire à hantavirus et le diagnostic de pneumonie chez les patients immunodéprimés. Les virus respiratoires sont de plus en plus reconnus comme des causes importantes de maladies sévères des voies respiratoires inférieures chez les hôtes immunodéprimés, en particulier chez les patients traités pour hémopathies malignes. La PCR offre la possibilité d’un diagnostic et d’un traitement précoces. Le test PCR des échantillons de lavage broncho-alvéolaire peut également être un outil utile pour le diagnostic de la pneumonie à cytomégalovirus dans la moelle osseuse. et receveurs de greffe d’organe solide

Conclusions

La PCR possède de nombreux attributs qui en font un test de diagnostic utile pour la pneumonie Cependant, aucun test diagnostique unique de pneumonie ne devrait apparaître, et les cliniciens devront rester au courant des forces et des faiblesses des nouveaux tests diagnostiques pour des pathogènes spécifiques. Des tests de PCR pour utilisation avec des échantillons respiratoires seront disponibles dans les prochaines années, y compris certains capables de détecter plusieurs pathogènes via un format multiplex. Cependant, des protocoles standard devront d’abord être établis avant que la PCR et les autres méthodes d’amplification ne deviennent routinières. outils de diagnostic

Remerciements

Je suis reconnaissant pour le soutien continu, l’intérêt et l’expertise technique de mes collègues de l’Unité de microbiologie des laboratoires de santé de Canterbury Christchurch, Nouvelle-Zélande |

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