Tests de sensibilité aux antimicrobiens: Besoins spéciaux pour les organismes fragiles et les mécanismes de résistance difficiles à détecter

Les laboratoires de microbiologie clinique sont confrontés au défi de détecter avec précision la résistance émergente aux antibiotiques parmi un certain nombre de pathogènes bactériens Ces dernières années, la résistance à la vancomycine chez les entérocoques est devenue prévalente, tout comme la résistance à la pénicilline et la multirésistance aux pneumocoques Plus récemment, les souches de Staphylococcus résistant à la méthicilline Des techniques moléculaires ont démontré qu’il existe encore des problèmes de détection de la résistance à la méthicilline chez les staphylocoques, en particulier chez les espèces coagulase-négatives. Chez les membres de la famille des Enterobacteriaceae, les enzymes β-lactamases mutées peuvent conférer des -détection de la résistance aux pénicillines et aux céphalosporines de génération ultérieure Les bactéries anaérobies ne sont plus entièrement prédictibles de leur sensibilité aux agents qui pourraient être sélectionnés pour un traitement empirique. Par conséquent, les laboratoires de microbiologie clinique pourraient ne pas être en mesure de dépendre d’un seul Pour une détection fiable, les laboratoires peuvent avoir besoin d’utiliser des méthodes de test de susceptibilité quantitatives conventionnelles ou d’utiliser des tests de dépistage de la gélose à concentration unique spécialement développés pour certaines espèces résistantes. Certains de ces tests de dépistage sont très efficaces. spécifiques, tandis que d’autres peuvent nécessiter des tests de confirmation supplémentaires pour obtenir des résultats définitifs. Par conséquent, les laboratoires doivent conserver la possibilité d’appliquer plusieurs approches différentes pour détecter la résistance chez les bactéries pathogènes communes et rarement rencontrées.

Les laboratoires de microbiologie clinique sont confrontés au défi de détecter avec précision la résistance émergente aux antibiotiques parmi plusieurs pathogènes bactériens importants. Certains d’entre eux sont des organismes exigeants qui requièrent des milieux enrichis et des conditions de croissance modifiées pour des tests de sensibilité fiables, par exemple Streptococcus pneumoniae. par exemple, les entérocoques résistant à la vancomycine, les staphylocoques à sensibilité réduite à la vancomycine, les staphylocoques résistants à la méthicilline et les bacilles à Gram négatif produisant des β-lactamases à spectre étendu [les BLSE] être capable de s’appuyer sur une seule méthode de test de sensibilité ou sur un système commercial pour détecter tous ces organismes résistants émergents. Pour une détection fiable, il peut être nécessaire d’utiliser des procédures MIC classiques de dilution en milieu bouillon ou agar, des tests spéciaux de concentration de médicaments fixes, Cependant, avec plusieurs des méthodes de dépistage, il est important de confirmer la résistance présomptive en effectuant des tests phénotypiques plus définitifs, par exemple, des tests conçus pour détecter la résistance à la vancomycine ou la résistance médiée par les BLSE. Des méthodes d’essai pratiques sont disponibles pour les laboratoires de grande et de petite taille. Dans un proche avenir, il peut devenir pratique d’utiliser des méthodes de diagnostic moléculaire sensibles et spécifiques capables de détecter les gènes les plus souvent associés. avec résistance

Lorsque les méthodes standard doivent être modifiées ou que des méthodes alternatives doivent être appliquées

Dans un article précédent , les méthodes de test de sensibilité des bactéries non parasitaires communes ont été examinées. Ces méthodes incluaient la dilution en bouillon et agar, le gradient antimicrobien, la diffusion des disques et des systèmes automatisés pour la réalisation des tests de sensibilité dans les laboratoires cliniques. pour tester les bactéries qui se développent rapidement dans & lt; h) Bouillon ou agar Mueller-Hinton non supplémenté pendant l’incubation dans l’air ambiant Au moins% des isolats cliniques peuvent être testés par ces méthodes, y compris les staphylocoques, entérocoques, entérobactéries et espèces Pseudomonas et Acinetobacter. Cependant, une résistance cliniquement importante est apparue chez Streptococcus pneumoniae, certaines autres espèces de Streptococcus, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae et certaines bactéries anaérobies Ces organismes nécessitent des milieux de croissance plus complexes, contenant généralement du sang ou des produits sanguins, et d’autres additifs de croissance, et selon la méthode utilisée, ils peuvent nécessiter Atmosphère d’incubation enrichie ou strictement anaérobie Cependant, malgré le besoin de milieux enrichis et d’atmosphères d’incubation différentes, d’autres paramètres de tests de susceptibilité normalisés pour les bactéries non parasitaires sont maintenus. Modifications importantes des méthodes standard décrites dans cette revue Les méthodes de diagnostic moléculaires qui démontrent des gènes bien caractérisés codant pour des mécanismes de résistance émergent comme les nouveaux critères définissant la résistance dans les isolats bactériens individuels Cependant, les bactéries idiotes peuvent être difficiles à détecter de manière fiable par dilution standard, diffusion, ou instrument. Les tests de résistance qui utilisent une concentration critique d’un agent antimicrobien sont une méthode pratique pour reconnaître avec précision la résistance à la méthicilline dans la résistance aux staphylocoques, à la vancomycine et aux aminoglycosides dans les entérocoques, ou la présence d’une BLSE chez certaines bactéries gram-négatives communes. propriétés de résistance subtiles ou difficiles à détecter dans les bactéries pathogènes communes sont également décrites ci-dessous

Test d’organismes nutritionnellement fastidieux

Bactéries facultatives Les tests standard de microdilution en bouillon, dilution en agar et diffusion sur disque peuvent être adaptés pour tester plusieurs espèces bactériennes exigeantes sur le plan nutritionnel en modifiant le milieu d’essai et les conditions d’incubation. Le NCCLS a développé et standardisé des méthodes d’essai pour les espèces Haemophilus, N gonorrhoeae, Des espèces de Streptococcus comprenant S pneumoniae et, plus récemment, Helicobacter pylori H influenzae peuvent être testées en utilisant un milieu de Mueller-Hinton supplémenté appelé milieu d’essai d’hémophilus HTM; Le HTM comprend l’hématine, le nicotinamide adénine dinucléotide et l’extrait de levure comme supplément pour la croissance des Haemophilus, et nécessite une incubation dans une atmosphère de% CO quand il est utilisé dans la formulation d’agar Malgré ces additifs, les versions de bouillon et d’agar sont transparentes et seulement légèrement plus sombre que le milieu Mueller-Hinton

ou Deuxièmement, le test du disque ne fournit pas une précision acceptable avec certains des médicaments les plus importants, par exemple, les céphalosporines à spectre étendu lors de tests contre les pneumocoques Une approche pratique utilisée par certains laboratoires est d’appliquer des bandelettes de test E sélectionnées, par exemple, pénicilline et céfotaxime ou ceftriaxone avec des disques pour médicaments non β-lactamines, par exemple, érythromycine, triméthoprime / sulfaméthoxazole ou quinolone sur la même grande gélose au sang de mouton de Mueller-Hinton Bien qu’il s’agisse d’un test très pratique méthode, le personnel de laboratoire doit vérifier que le médicament particulier et l’organisme spécifique qu’ils souhaitent tester sont une combinaison ayant reçu l’autorisation de la FDA pour usage clinique. Les méthodes de référence NCCLS qui ont été récemment développées pour H pylori sont pertinentes pour le moment. fins de recherche, y compris pour la comparaison des activités in vitro de nouveaux composés en cours de développement pour le traitement de la gastrite H pylori Clinica l Les épreuves de laboratoire de cette espèce ne sont pas recommandées à l’heure actuelle. Dans les cas où il semble cliniquement nécessaire de tester un isolat particulier, par exemple en cas d’échec apparent du traitement empirique, un laboratoire pourrait envisager d’utiliser des bandelettes E pour l’ampicilline, la clarithromycine ou métronidazole avec des plaques de gélose au sang de mouton Mueller-Hinton% incubées dans un environnement microaérophile à ° C pendant des jours Cependant, il convient de noter que le test E n’a pas encore reçu l’autorisation FDA pour H pyloriLast, en raison de la susceptibilité prévisible de Moraxella catarrhalis à des agents autres que la pénicilline ou l’amoxicilline , le NCCLS recommande de tester directement les β-lactamases des isolats significatifs mais pas les tests de sensibilité à la croissance avec d’autres agents antimicrobiens Bactéries anaérobies pas une procédure standard dans de nombreux laboratoires de microbiologie clinique pour le moment. Cela est dû en tout schéma antibiotique empirique recommandé pour le traitement des infections anaérobies et la difficulté technique d’effectuer des tests anaérobies Souvent, les cultures d’échantillons prélevés sur des infections anaérobies révèlent la présence de multiples espèces facultatives et anaérobies qui doivent être systématiquement isolées et testées séparément, ce qui peut prendre Plusieurs jours En outre, la méthode MIC de référence NCCLS pour les anaérobies est une procédure de dilution en gélose qui nécessite la préparation de dilutions d’antibiotiques et de milieux spéciaux sur le site d’essai . Les laboratoires ne peuvent tester les isolats que sur des sites sélectionnés, par exemple, le sang ou le matériel d’abcès cérébraux, les espèces anaérobies les plus susceptibles d’abriter des mécanismes de résistance, par exemple les membres du groupe Bacteroides fragilis ou certai n Espèces de Clostridium, ou par demandes spécifiques de médecins au cas par cas D’autres laboratoires peuvent choisir d’effectuer des tests de surveillance périodiques des isolats cliniques stockés afin de générer des données locales pour guider les cliniciens par une thérapie empirique. Le NCCLS recommande une méthode de dilution en gélose comme méthode de référence pour les anaérobies. Cette méthode utilise de la gélose Brucella additionnée de sang de mouton et d’autres additifs de croissance . utilise un log d’inoculum plus élevé, c.-à-d. cfu / spot que celui des organismes aérobies et nécessite une incubation dans une atmosphère de gaz anaérobie avant la détermination des CMI. Comme l’interprétation des extrémités MIC peut être plus difficile qu’avec les bactéries aérobies, la publication NCCLS sur les tests anaérobies comprend des photos couleur qui représentent différents points de terminaison et des guides pour leur interprétation appropriéeInterpre Le NCCLS recommande la dilution en agar pour les bactéries anaérobies et les souches anaérobies de contrôle de qualité La dilution en gélose n’étant pas une méthode pratique pour la plupart des laboratoires cliniques, le NCCLS a également décrit une procédure de microdilution en bouillon qui pourrait constituer un choix plus pratique. Utilisation Comprend l’utilisation du bouillon Wilkins-Chalgren, un inoculum de × cfu / mL plutôt que × cfu / mL, utilisé pour les aérobies, et l’incubation pour h dans une atmosphère anaérobie. Cependant, parce que tous les anaérobies ne poussent pas de façon fiable dans ce bouillon. En attendant, l’utilisation de bandelettes de test E sur gélose au sang brucellique incubée dans une atmosphère anaérobie représente une méthode pratique mais assez coûteuse pour tester des isolats cliniques d’anaérobies. ] Il est important de noter que les tests de diffusion sur disque ou d’élution sur disque ne sont pas recommandés pour les anaérobies car de tels tests ont produit de nombreux les erreurs

Mécanismes de résistance difficiles à détecter chez les organismes non-parasitaires

résultats faussement sensibles avec des souches résistantes à la méthicilline Dans de tels cas, les laboratoires ont été invités à ne pas signaler la sensibilité apparente de ces agents ou à les déclarer résistants sur la base de la réponse clinique médiocre reconnue aux staphylocoques résistants à la méthicilline. antibiotiques -lactam Parce que cette pratique était parfois déroutante pour le personnel de laboratoire et les médecins et parce qu’elle impliquait des tests inutiles, le NCCLS stipule maintenant que la pénicilline et l’oxacilline sont les seuls β-lactamines qui doivent être testés systématiquement contre les staphylocoques. On peut déduire avec précision les β-lactamines des résultats de tests effectués uniquement sur la pénicilline et l’oxacilline, comme suit: Les souches sensibles à la pénicilline peuvent être présumées sensibles à tous les β-lactamines ayant une activité reconnue contre les staphylocoques. Les souches résistantes à la pénicilline sont sensibles à l’oxacilline. sensibles à divers β-lactames, à l’exception du β-lactamase Les pénicillines telles que l’ampicilline, la mézlocilline, la pipéracilline et la ticarcilline Les staphylocoques résistants à l’oxacilline sont résistants à tous les antibiotiques β-lactamines actuellement disponibles, y compris les combinaisons pénicilline-β-lactamase-inhi-bitor Par conséquent, les points de cassure de sensibilité pour diverses céphalosporines ou autres β Des médicaments à base de lactame ont été conservés à des fins de recherche ou d’épidémiologie, il n’est pas nécessaire ni utile pour les laboratoires cliniques de tester ces agents contre les staphylocoques de manière systématique Diminution de la sensibilité à la vancomycine chez les staphylocoques. Les entérocoques pourraient être transférés aux staphylocoques, en particulier aux SARM, créant ainsi un S aureus résistant à la vancomycine. Le groupe de gènes vanA a été transféré in vitro sur un plasmide à un receveur S aureus, créant ainsi une souche parfaitement fonctionnelle résistante à la vancomycine . pas encore survenu dans la nature, les souches à vancom réduit sensibilité au ycin ont été signalés au Japon et plusieurs sites aux États-Unis Ces souches sont maintenant appelées VANCOMYCINE-intermédiaire S aureus VISA ou glycopeptide-intermédiaire S aureus GISA Ces souches ont démontré une CMI vancomycine de μg / mL et sont associés à une paroi cellulaire épaissie et à des niveaux accrus de certains précurseurs de paroi cellulaire Il n’a pas été démontré qu’ils contiennent les séquences vanA, vanB ou vanC des espèces Enterococcus En outre, les isolats intermédiaires de vancomycine des staphylocoques à coagulase négative Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus haemolyticus ont été signalés dans le passé Le NCCLS a modifié les points de rupture de la diffusion de la vancomycine pour faciliter la détection de la résistance à la vancomycine chez les staphylocoques. être suffisant pour la détection des souches VISA signalées à ce jour Tenover et al ont examiné plusieurs Leurs résultats peuvent être résumés en disant que la plupart des méthodes de CMI qui intègrent au moins une période d’incubation d’une nuit ≥ h semblent offrir une détection fiable de VISA. En outre, l’agar de dépistage de la vancomycine développé pour la détection des entérocoques résistants à la vancomycine VRE semble offrir un moyen très simple et peu coûteux de dépister les instruments VISAT actuellement commercialisés aux États-Unis, qui fournissent des résultats de sensibilité rapides, doivent être utilisés avec précaution Avec l’une des procédures, les Centers for Disease Control et prévention CDC recommande que les isolats de S aureus avec des CMI de vancomycine ≥ μg / mL soient considérés comme «potentiellement résistants» et transmis à un laboratoire de référence en santé publique pour une caractérisation plus poussée Résistance à la vancomycine chez les entérocoques États dans la dernière décennie Un comité de la CDC a ont publié des recommandations pour prévenir la propagation des ERV dans les établissements de santé, y compris une détection rapide et précise de ces souches par les laboratoires de microbiologie clinique Cependant, des tests de sensibilité aux antimicrobiens conventionnels et commerciaux ont posé des problèmes de détection précise des ERV. méthodes Pour cette raison, le NCCLS a recommandé que le test le plus simple et le plus sensible pour la reconnaissance des ERV soit le test utilisant la gélose à la vancomycine, décrite à l’origine par Willey et al Cette méthode incorpore l’ug / mL de vancomycine dans l’infusion cerveau-coeur Agar BHI, inoculation ponctuelle avec ou cfu, et incubation pour un tableau complet à ° C Des études comparant l’utilisation de cette méthode avec la présence des gènes vanA, vanB ou vanC ont confirmé la sensibilité de cette approche pour détection des ERV Cependant, il est important de noter que la gélose de dépistage de la vancomycine n’est pas entièrement spécifique pour les résistances de type vanA et vanB.

Des tests MIC ou de diffusion sur disque peuvent être réalisés avec un substrat testé par la céphalosporine seule et avec addition d’acide clavulanique. Comme les ESBL sont des enzymes à médiation plasmidique, Ils sont inhibés par les inhibiteurs des β-lactamases, le clavulanate, le sulbactam et le tazobactam. Le NCCLS recommande l’utilisation du clavulanate ajouté en concentration fixe à la fois à la ceftazidime et au céfotaxime pour une confirmation optimale de la plupart des BLSE tableau de la CMI de la céphalosporine plus clavulanate doit être au moins dilutions log ou -fold plus bas que lorsque la céphalosporine est testée seule Dans le test du disque, le diamètre de la zone d’inhibition devrait augmenter d’au moins mm en présence du clavulanate Ces les tests de confirmation sont probablement les plus importants avec les isolats d’E. coli et de Klebsiella oxytoca, dans lesquels la production excessive de la β-lactamase native chromosomique AmpC a nd K, respectivement occasionnellement donner lieu à résistance à la cefpodoxime En revanche, le cefpodoxime est à la fois un indicateur sensible et spécifique d’une BLSE chez K pneumoniae Un autre indice potentiel de la présence d’une BLSE est la co-résistance à la gentamicine et au triméthoprime / sulfaméthoxazole associés aux gènes de résistance portés sur le même plasmide que ceux codant pour les BLSE Les laboratoires devraient faire des efforts raisonnables pour détecter les BLSE chez ces genres Gram négatif très communs. Lorsqu’ils sont détectés et confirmés par les méthodes décrites ci-dessus, le laboratoire devrait modifier le résultat. catégorie “résistance” pour toutes les pénicillines, l’aztréonam et les céphalosporines vraies, mais pas les céphamycines, c.-à-d., le céfotétan, le céfmétazole et la céfoxitine Autrement, un laboratoire pourrait inclure un avertissement qu’un isolat produit une BLSE et devrait être considéré comme cliniquement résistant aux composés notés ci-dessusDétection directe de certaines enzymes qui induisent une résistance Simp Il existe des tests rapides permettant la détection directe des agents de résistance bactériens. Plus précisément, certains tests de β-lactamases et de chloramphénicol acétyltransférase β-lactamase peuvent incorporer la pénicilline comme substrat et un système indicateur qui détecte sa destruction par des enzymes bactériennes ou peut utiliser une céphalosporine chromogène, par exemple une nitrocefine qui change de couleur lorsqu’elle est hydrolysée. par une β-lactamase Avec l’un ou l’autre de ces réactifs, le test direct de colonies bactériennes prélevées sur une plaque de croissance initiale peut démontrer en quelques minutes qu’une enzyme hydrolyse la pénicilline ainsi que l’ampicilline et l’amoxicilline. Peu d’espèces bactériennes pour lesquelles cette approche peut être appliquée: H influenzae, N gonorrhoeae, M catarrhalis, staphylocoques, entérocoques et certaines espèces bactériennes anaérobies [,,] Ces tests ne détectent pas la résistance aux pénicillines due à d’autres mécanismes tels que l’altération des PB ou la résistance aux antibiotiques ß-lactam à spectre étendu; par exemple, ces tests ne peuvent pas être utilisés pour détecter ESBLChloramphenicol acetyl transferase CAT peut être détecté par un tube rapide ou un test de papier filtre en -h et fournir une preuve de résistance au chloramphenicol chez H influenzae, S pneumoniae et certaines entérobactéries La plupart des isolats de H influenzae et de S pneumoniae peuvent être attribués à la production de cette enzyme Cependant, comme l’utilisation du chloramphénicol a diminué de façon spectaculaire dans les pays développés, le test CAT est rarement effectué dans les laboratoires cliniques. Il existe plusieurs autres espèces de bactéries qui peuvent contenir d’importants mécanismes de résistance intrinsèque ou acquise qui rendent la thérapie problématique. Malheureusement, peu de progrès ont été accomplis vers la standardisation des tests de susceptibilité des espèces de Corynebacterium, des Bacillus, des bacilles gram négatif. tinobacillus-Cardiobacterium-E En outre, Stenotrophomonas maltophilia et Burkholderia cepacia présentent des problèmes parce que les résultats de la catégorie d’interprétation de la diffusion sur disque ou des instruments automatisés peuvent ne pas être en accord avec les catégories de susceptibilité basées sur les déterminations MIC classiques. Le NCCLS recommande actuellement En effet, avec des organismes pour lesquels les seuils d’interprétation de diffusion du disque n’ont pas été spécifiquement dérivés, il peut être plus prudent de s’appuyer sur des schémas empiriques soutenus par des citations dans la littérature. test de susceptibilité sur un isolat particulier, l’approche la plus fiable peut être de déterminer les CMI des médicaments pertinents par une procédure MIC traditionnelle, par exemple, microdilution en bouillon. L’interprétation des CMI résultants doit alors appartenir au spécialiste des maladies infectieuses à la lumière de l’état du patient. expériences du clinicien

Approches futures de la détection de la résistance aux antimicrobiens

L’approche la plus récente et peut-être la plus définitive de la détection de la résistance aux antimicrobiens est la détection directe des gènes codant certains mécanismes de résistance. Le gène responsable de la résistance à la méthicilline chez les espèces Staphylococcus, vanA et vanB, est le gène responsable de la résistance à la vancomycine. entérocoques, et diverses β-lactamases et enzymes inactivant les aminoglycosides Les méthodes faisant appel à des sondes génétiques ou à des techniques d’amplification des acides nucléiques offrent la promesse d’une sensibilité, d’une spécificité et d’une rapidité excellentes dans la détection des gènes de résistance. Malgré l’exactitude de cette approche avec certains traits de résistance, aucun test de génétique moléculaire n’est encore disponible sur le marché ou approuvé par la FDA pour utilisation en laboratoire clinique Limites potentielles de cette approche comprendre le grand nombre de mécanismes de résistance différents qui auraient besoin d’être détectés, par exemple, de nombreuses β-lactamases produites séparément ou ensemble et la possibilité que certains gènes qui pourraient être détectés ne soient pas exprimés ou n’aboutissent pas à une résistance phénotypique de multiples mutations entraînent le remodelage des cibles moléculaires affectées par les antibiotiques, par exemple, les PBP dans les pneumocoques Il peut donc être nécessaire de séquencer les gènes d’intérêt afin de détecter des mutations subtiles. Une avancée technologique récente qui peut faciliter à la fois L’application de la technologie des puces informatiques aux analyses génétiques Plusieurs entreprises développent des produits à base de puces informatiques qui permettront la détection de plusieurs centaines de gènes de résistance simultanément ou rapidement. séquençage de certains gènes impliqués dans les médiateurs de la résistance. La mise au point de tests hautement définitifs de résistance aux antimicrobiens pourrait devenir une approche pratique pour une application systématique mais sélective à l’avenir et pourrait déboucher sur un nouveau paradigme dans les tests de sensibilité aux antimicrobiens