La sédimentation à l’eau de Javel: une opportunité d’optimiser la microscopie des frottis pour le diagnostic de la tuberculose dans les contextes de forte prévalence du VIH

Contexte L’objectif de l’étude était d’évaluer la performance et la faisabilité du diagnostic de la tuberculose par microscopie des expectorations après sédimentation par blanchiment, par rapport à la microscopie à frottis direct classique, dans un contexte de forte prévalence des méthodes VIH. 50% des individus atteints de tuberculose sont infectés par le VIH, les individus suspects de tuberculose pulmonaire ont présenté 3 échantillons d’expectorations pendant 2 jours consécutifs, qui ont été examinés par évaluation aveugle. Les frottis colorés par Ziehl-Neelsen ont été réalisés avec des spécimens frais et traités avec Deux seuils différents pour les bacilles acido-alcoolo-résistants (AFB) pour 100 champs HPF à haute puissance ont été utilisés pour définir un frottis positif:> 10 AFB / 100 HPF et 1 AFB / 100 HPF Quatre cas à frottis positif les définitions, basées sur 1 ou 2 frottis positifs avec le seuil de 1 AFB ou de 10 AFB, ont été utilisées. Résultats de 1879 échantillons de 644 patients, 363 193 % et 460 245% étaient positifs par microscopie de sédimentation à l’eau de Javel, comparés à 301 160% et 374 199% par microscopie à frottis direct, avec l’utilisation des 10 seuils AFB / 100 HPF P1 001 et 1 AFB / 100 HPF P1 001 respectivement Indépendamment de la définition de cas utilisée, la microscopie de sédimentation a détecté significativement plus de cas positifs que la microscopie de frottis direct: 267% 172 de 644 contre 217% 140 de 644, respectivement, avec la définition de 1 frottis positif et 1 AFB / 100 HPF seuil de coupure P1 001 et 214% 138 de 644 contre 186% 120 de 644, respectivement, avec la définition de cas de 1 frottis positif et la limite de coupure 10 AFB / 100 HPF P1 001 La reproductibilité intra- et intrareader était favorable, avec des coefficients κ de 083 et 091, respectivement La sédimentation à l’eau de Javel était relativement peu coûteuse et ne demandait pas beaucoup de temps. Conclusions La microscopie par sédimentation par blanchiment est une méthode simple et efficace pour améliorer le rendement de la microscopie des frottis dans un contexte de forte prévalence du VIH. de cette méthode, dans des conditions opérationnelles, est nécessaire d’urgence pour déterminer son potentiel en tant qu’outil de lutte antituberculeuse

La microscopie des frottis d’expectoration directe, malgré sa faible sensibilité, reste la pierre angulaire de la tuberculose. Diagnostic de la tuberculose [1] Des diagnostics plus sensibles sont urgemment nécessaires pour remplacer la microscopie dans les laboratoires périphériques et permettre le diagnostic de tuberculose dans les centres de santé. peu sont susceptibles d’être des substituts appropriés pour la microscopie ou de rapprocher le diagnostic de la tuberculose des communautés à court terme [2] Des séries récentes de revues systématiques indiquent que la microscopie pour le diagnostic de la tuberculose peut être optimisée, avec des bénéfices considérables pour les patients Les approches proposées comprennent la digestion des expectorations avec de l’eau de Javel, suivie d’une étape de concentration des échantillons, avant la préparation du frottis [3, 8]. Les évaluations des diagnostics de maladies infectieuses sont souvent de mauvaise qualité [9]. ] Revues systématiques du diagnostic de la tuberculose, y compris la série sur les opti microscopie des frottis de microscopie mentionnée ci-dessus, signalent que les évaluations mal conçues et mal appliquées sont courantes et donnent des résultats très variables [3-5, 10, 11] Les lacunes comprennent l’échec de l’évaluation parmi les populations de patients les plus appropriées, c.-à-d. suspicion de tuberculose chez les patients hospitalisés, manque d’aveuglement de l’échantillon, absence de contrôle qualité de la microscopie et manque d’attention à la qualité et à la stabilité de l’eau de Javel. Utilisation de différents critères pour définir un cas suspect de tuberculose ou différents seuils Les études sur la microscopie à l’eau de Javel n’ont pas réussi à répondre à trois questions opérationnelles importantes concernant la microscopie pour le diagnostic de la tuberculose: 1 peuvent-elles bénéficier aux cliniques périphériques, où la majorité des patients consultent; 2 peut-il améliorer le diagnostic de la tuberculose chez les patients infectés par le VIH, pour qui le besoin d’une meilleure détection de la maladie paucibacillaire est critique; et 3 quel est son bénéfice lorsqu’un bac bactérien acido-alcoolo-sensible est utilisé pour définir un frottis positif et un frottis positif [4] Les méthodes de microscopie à l’eau de Javel qui ont été évaluées incluent celles qui utilisent différentes concentrations de blanchiment et différentes concentrations méthodes, c.-à-d., centrifugation, flottation ou sédimentation En outre, certains travailleurs ont décrit l’addition d’eau distillée au mélange d’expectoration-blanchiment avant l’étape de concentration, alors que d’autres ne le font pas. les différentes méthodes proposées, celles qui utilisent l’eau de Javel locale et la sédimentation nocturne à température ambiante semblent peu coûteuses et adaptées aux laboratoires périphériques dans les pays à faible revenu Nous avons entrepris d’évaluer une telle méthode chez les patients suspects de tuberculose dans un service de santé périphérique avec une forte prévalence du VIH Malheureusement, parce que la culture de Mycobacterium tu la berculose n’était pas disponible dans notre clinique, comme c’est le cas dans de nombreux pays en développement, nous ne rapportons pas de données sur la culture.

Méthodes

L’évaluation des frottis d’eau de Javel n’a pas été réalisée en raison de la digestion des éléments cellulaires dans les frottis. Dans le cadre de la gestion interne de la qualité, 100% des frottis positifs et 10% des frottis négatifs ont été réexaminés à l’aveugle. a consisté en 100 frottis prélevés au hasard et réexaminés aveuglément à la fin de l’étude par le laboratoire de tuberculose du Kenya Medical Research Institute KEMRI Nairobi, KenyaNaOCl solution L’eau de javel domestique à 35% disponible sur le marché kenyan Jik Bleach Regular; Reckitt Benckiser Afrique de l’Est; Ingrédient actif, l’hypochlorite de sodium à 35% mol / vol emballé a été utilisé sans addition d’eau distillée [19] Le même lot d’eau de Javel a été utilisé pendant toute la durée de l’étude de 10 mois Pour réduire le risque d’oxydation, la solution a été stockée Dans des bouteilles sombres de 750 ml, avec un espace minimal dans une pièce sombre [20] La température ambiante était surveillée Chaque semaine, une aliquote de 250 ml de “solution de travail” de blanchiment était collectée pour traiter les échantillons pendant cette semaine. La date et l’heure d’aliquotage de la solution de travail ont été enregistrées sur le récipient hebdomadaire. Avant utilisation, la présence de chlore libre a été évaluée en utilisant un testeur de piscine avec un type de poche de diéthyl-p-phénylène diamine 1 ; gamme de chlore, 01-60 mg / L après dilution préalable à d = 2104 La qualité de NaOCl a été jugée adéquate si la concentration se situait entre 15 et 2 mg / L, conformément aux recommandations du fabricantRéproductibilité Sélections aléatoires de frottis directs et d’eau de Javel frottis ont été lus une deuxième fois le même jour par un technicien différent et ont été lus par le même technicien 24 h après la première lecture, pour évaluer respectivement la reproductibilité inter- et intrareader. Le superviseur du laboratoire a masqué l’identification de la lame pour s’assurer que La lecture était aveugle Aspects opérationnels Une liste de paramètres a été mesurée pour évaluer la faisabilité de la microscopie de sédimentation par comparaison à celle de la microscopie directe: 1 la durée du blanchiment, soit le temps passé à ajouter l’eau de Javel au tube et à secouer le tube, 2 sédimentation, 3 le maculage, y compris le séchage de la lame et la coloration d’un lot quotidien de spécimens, et 4 la durée de la rea La température au début et à la fin de la sédimentation a été surveillée. Le coût des réactifs et des consommables pour effectuer la microscopie de sédimentation à l’eau de Javel a été évalué sur la base du prix du marché kenyan. pourcentage des cas de frottis positifs obtenus par microscopie de sédimentation de l’eau de Javel par rapport à la microscopie frottis direct a été calculé [8] avec une moyenne de 20% des cas de frottis positifs détectés régulièrement par microscopie à frottis direct dans la clinique de l’étude, un risque de 005, une puissance de 80%, et un taux de décrochage de 10%, la taille de l’échantillon était de 690 patients avec un taux de détection des frottis positifs de 20%, un coefficient K prévu & gt; 08 et une précision de 10% la reproductibilité du test était de 220 frottis [21] Analyse des données Les données ont été saisies deux fois en utilisant Epidata 31 EpiData Association et ont été analysées à l’aide de SPSS 110 pour Windows SPSS. Les caractéristiques des patients, des échantillons et des frottis étaient ont décrit des échantillons de frottis positifs et les taux de détection des patients ont été comparés entre la microscopie de sédimentation de blanchiment et microscopique des frottis direct avec l’utilisation du test de McNemar pour données appariées Quatre définitions d’un cas à frottis positif ont été utilisés: 1 AFB sur 2 3 frottis examiné, 1 qui avait ⩾10 AFB / 100 HPF détecté [22] 2 ⩾1 AFB / 100 HPF dans 2 des 3 frottis [14] 3 ⩾10 AFB / 100 HPF dans 1 des 3 frottis, et 4 ⩾1 AFB / 100 HPF dans 1 des 3 Gain smearsThe des frottis de blanchiment a été calculé comme l’augmentation des frottis positifs par microscopie de sédimentation de blanchiment, par rapport à la microscopie à étalement direct, divisé par le nombre total de frottis positifs détectés par microscopie à frottis direct de même, le gain de frottis directs a été calculé comme l’augmentation dans les frottis positifs par microscopie à frottis direct, comparé à la microscopie par sédimentation à l’eau de Javel, divisé par le nombre total de frottis positifs détectés par microscopie de sédimentation à l’eau de Javel Le même calcul a été fait pour les cas à frottis positif. Le rendement de détection de l’oreille de la microscopie de sédimentation de blanchiment effectué sur le premier échantillon a été comparé à celui de la microscopie de frottis direct sur les 2 premiers spécimens et sur les 3 spécimens, en utilisant les définitions de cas 3 et 4 décrites ci-dessus. par le calcul du coefficient κ, qui mesure l’accord entre 2 lectures Un coefficient κ ⩾080 signifie un accord presque parfaitLe Comité National d’Ethique du KEMRI et le Comité de Protection des Personnes de Saint Germain en Laye, France ont approuvé l’étude. obtenu des participants

Résultats

Un total de 788 patients suspects de tuberculose pulmonaire ont été examinés, et 644 817% ont été recrutés pour l’étude chiffre 1 L’âge moyen était de 32 ans SD, 103, le ratio hommes / femmes était 08 287:356; données manquantes pour un patient, 121 188% des patients avaient des antécédents de tuberculose, 37 57% ont reçu un traitement antibiotique à large spectre dans les 2 semaines précédant le recrutement, et 12 19% ont eu une radiographie thoracique Tous les patients ont eu une expectoration 593 921% ont eu de la fièvre la semaine dernière, 596 925% ont eu des douleurs thoraciques, 109 169% ont eu une hémoptysie, 550 854% ont eu des sueurs nocturnes, 245 380% ont eu une perte de poids et 484 752% avaient une perte d’appétit

Figure 1Voir grand Diapositive Diagramme d’étude ICF, formulaire de consentement éclairé Figure 1Voir grand DiapositiveDétaillé Diagramme d’étude ICF, formulaire de consentement éclairé Parmi les 644 patients recrutés, 614 953% ont fourni 3 spécimens, 7 11% 2 spécimens et 23 36% 1 spécimen. 1879 spécimens ont été collectés et traités Sur ces spécimens, 1401 746% étaient purulents, 414 220% mucoïdes, 56 30% étaient tachés de sang et 8 04% étaient salivaires De 1879 frottis directs, 1855 987% étaient bons, 5 03% étaient Dans 19% des 1879 échantillons, les frottis de blanchiment étaient illisibles. Quel que soit le seuil utilisé pour définir un frottis positif, la microscopie par sédimentation par décoloration a donné des résultats significatifs. frottis plus positifs que la microscopie à frottis direct Avec le seuil de 10 AFB / 100 HPF ou 1 AFB / 100 HPF, 62 206% des 301 frottis positifs et 86 232% des 371 frottis positifs, respectivement, ont été détectés par le sédiment de blanchiment Comparaison avec 10 28% de 363 frottis positifs et 2 04% de 460 frottis positifs détectés par microscopie à frottis direct significativement Moins de frottis positifs ont été ratés par microscopie de sédimentation avec un seuil de 1 AFB / 100 HPF qu’avec le seuil Sur les 363 frottis positifs avec le seuil de 10 AFB / 100 HPF détectés par microscopie de sédimentation à l’eau de Javel, 289 796% ont été détectés positifs par microscopie à frottis direct Sur les 74 frottis positifs restants détectés uniquement par sédimentation à l’eau de Javel microscopie, 51 689% ont montré des résultats faibles 1-9 AFB / 100 HPF et 23 311% étaient négatifs par microscopie à frottis direct Le bénéfice de la méthode de sédimentation par blanchiment était plus grand pour les spécimens mucoïdes que pour les spécimens purulents

Tableau 1View largeTélécharger slideDétection positive des frottis parmi 1879 échantillons, avec un seuil de 10 ou 1 bacilles acido-alcoolo-résistants AFB pour 100 champs de haute puissance HPFTable 1View largeTélécharger slideDétection de frottis positif parmi 1879 échantillons, avec un seuil de 10 ou 1 acid-fast bacille AFB pour 100 champs de haute puissance HPF

Tableau 2View largeDownload slideDétection de frottis positif parmi 1879 spécimens par aspect macroscopique, avec un seuil de 10 ou 1 bacilles acido-alcoolo-résistants AFB pour 100 champs de haute puissance HPFTable 2View largeDispositifDétection de frottis positif parmi 1879 spécimens par aspect macroscopique, avec un seuil de 10 ou 1 bacilles acido-alcoolo-résistants pour 100 champs de haute puissance HP Les résultats de détection de cas à bacilloscopie positive sont présentés dans le tableau 3. Indépendamment de la définition de cas, la microscopie par sédimentation a détecté significativement plus de cas à bacilloscopie que la microscopie directe. microscopie de frottis effectuée sur 2 ou 3 échantillons, microscopie de sédimentation de blanchiment effectuée sur le premier échantillon détectée comme de nombreux cas à frottis positif avec définition de cas 3 et détectés significativement plus de cas à frottis positif avec définition de cas 4 Tableau 4 Microscopie à frottis direct et microscopie par sédimentation effectué sur le premier échantillon détecté seulement 2 plus de cas que ne l’a fait l’eau de Javel la microscopie seule

Tableau 3View largeDownload slideDétection de cas positive avec l’utilisation de différentes définitions de casTable 3View largeDownload slideDétection de cas positive avec utilisation de différentes définitions de cas

Tableau 4View largeDownloadDétection positive des cas avec l’utilisation de la microscopie de sédimentation et / ou de la microscopie à frottis direct et définition des cas 3 et 4Table 4View largeDownloadDétection des cas positifs avec l’utilisation de la microscopie de sédimentation et / ou la microscopie directe et les définitions de cas 3 4La reproductibilité intra- et intrareader des deux méthodes a montré des coefficients κ ⩾08 tableau 5 Le contrôle de qualité a rapporté un taux de concordance de 95% à 100% entre les résultats du technicien et les résultats du superviseur pour le contrôle interne mensuel et de 99%

Tableau 5View largeDownload slideRésultats des études de reproductibilité inter et intrareaderTable 5View largeDownload slideRésultats des études de reproductibilité inter et intrareaderEn considérant les aspects opérationnels, une médiane de 12 échantillons intervalle interquartile [IQR], 85-15 ont été traités quotidiennement. 186 ± 76 min, et la durée de sédimentation ± SD moyenne était de 168 ± 08 h La température médiane au début de l’après-midi et à la fin de la matinée de sédimentation était de 300 ° C IQR, 272-327 et 260 ° C IQR, 237- 280, respectivement Surveillance de la présence de chlore libre dans la solution de blanchiment a montré que les niveaux étaient adéquats, avec des concentrations de NaOCl de 15-2 mg / L aux contrôles hebdomadaires La durée ± SD de la préparation de frottis était plus longue pour les échantillons traités ± 256 min que pour les échantillons frais 214 ± 83 min; P <001, en raison du temps de séchage plus long des lames réalisées à partir des échantillons traités. La durée moyenne de coloration est la même pour les deux méthodes: 45 ± 104 min pour la microscopie de sédimentation et 471 ± 106 min pour la microscopie directe. une différence statistiquement significative a été observée dans la moyenne ± écart-type pour la lecture d'un frottis positif par microscopie de sédimentation à l'eau de Javel 31 ± 06 min comparé à la microscopie par frottis direct 30 ± 06 min Le coût supplémentaire du traitement était de 020 € / échantillon d'eau de javel et de produits jetables seringues de 2 ml, tubes coniques en plastique de 15 ml et pipettes en plastique

Discussion

est dans la fourchette attendue de 5% -20% pour les pays où la tuberculose est l’une des causes les plus fréquentes de toux chronique [16] Deuxièmement, la qualité de la microscopie des frottis était élevée, ce qui était la condition dans laquelle le bénéfice le plus faible la méthode de traitement des spécimens serait attendue [24] En effet, nous rapportons un avantage significatif associé à l’utilisation de la microscopie de sédimentation à l’eau de Javel dans un cadre de soins qui utilise déjà la microscopie à frottis direct optimisée et recueille des spécimens de haute qualité. Quatrièmement, notre méthode de blanchiment a été normalisée autant que possible, et différents aspects pratiques ont été surveillés. Contrairement aux méthodes utilisées dans les études précédentes, la méthode de traitement ne nécessitait pas de distillats. l’eau, qui simplifie la procédure et évite vraisemblablement la contamination des frottis avec des BAAR saprophytes provenant de l’eau du robinet, qui est utilisée couramment dans des Finalement, l’étude a été renforcée par sa méthodologie basée sur le recrutement d’individus consécutifs avec suspicion de tuberculose et une évaluation en aveugle. La méthode de sédimentation par blanchiment est simple et ne nécessite pas d’expertise supplémentaire au-delà de celle requise pour la microscopie à frottis direct classique. Les matériaux et les réactifs sont abordables et disponibles localement dans les pays où la tuberculose est endémique. La préparation des échantillons ne nécessite pas de charge de travail supplémentaire importante et le temps nécessaire au séchage des lames après le maculage ne nécessite pas de temps de travail supplémentaire. Comme l’ont montré des études antérieures [8], les techniciens ont signalé des difficultés à se concentrer, en raison de l’absence de matériel de base dans les frottis, et se sont plaints de la fatigue oculaire. La sédimentation par infiltration peut entraîner des frottis fragiles [24 Les 36 frottis de blanchiment illisibles à 19% étaient principalement causés par le frottis. En effet, le frottis peut se laver pendant la coloration de la lame et il faut faire attention à éviter ce problème. La surchauffe des lames peut entraîner la formation de cristaux d’hydroxyde. Lectures de compromis Un autre inconvénient de la sédimentation de l’eau de Javel est la faible stabilité de l’eau de Javel stockée dans des conditions sous-optimales [3, 8] Dans notre étude, nous avons surveillé la présence de chlore libre dans l’eau de Javel. solution, car la concentration la plus élevée pour un test simple de détection de chlore libre est de 250 mg / L Colorimètre; Wagtech, et des concentrations plus élevées nécessitent un titrage spectophotométrique. Cette surveillance nécessite un travail supplémentaire, qui peut introduire des erreurs de dilution et peut être difficile à effectuer dans des conditions de routine. durée de conservation acceptable d’au moins 6 mois si stocké dans des conditions appropriées, à savoir un endroit frais dans des bouteilles opaques et non réactives avec des bouchons hermétiques [20] Le retard de 1 jour de la sédimentation de nuit est une limitation qui peut être surmontée un temps de sédimentation plus court [3] Le pourcentage de frottis avec AFB qui ont été manqués par microscopie de sédimentation par décoloration, comparé à la microscopie à frottis direct, était relativement faible de 04% avec le seuil 1 AFB / 100 HPF et 27% avec le 10 AFB / 100 Seuil HPF En dépit de l’absence de culture limitant cette étude, ces frottis négatifs à la décoloration à l’eau de Javel étaient susceptibles d’être faussement négatifs, perchap s expliquée par la difficulté de focalisation mentionnée ci-dessus, la dispersion potentielle des AFB dans l’échantillon, la fragmentation des AFB après homogénéisation, ou la fragilité des frottis [24, 25] En raison de la même limitation de culture, la proportion de frottis positifs par Mycobacterium d’autres espèces que M tuberculosis n’a pas pu être rapporté Une étude récente menée dans un district de Nairobi a rapporté que les isolats de 82% des 85 spécimens positifs étaient identifiés comme espèces de Mycobacterium autres que M tuberculosis [26] En conclusion, cette étude suggère que la méthode de sédimentation à l’eau de Javel peut améliorer significativement le rendement de la microscopie pour le diagnostic de la tuberculose lorsqu’elle est utilisée dans une clinique périphérique dans un contexte de forte prévalence du VIH Son bénéfice reste significatif même si un seuil AFB sensible est utilisé La méthode est simple, abordable et appropriée pour les laboratoires qui effectuent déjà une microscopie Une évaluation supplémentaire, dans des conditions opérationnelles, est urgente Les analyses coût-efficacité des stratégies combinant la microscopie à frottis direct et la microscopie par sédimentation à l’eau de Javel sont nécessaires pour optimiser les services et équilibrer le besoin d’une sensibilité accrue avec la nécessité de prévenir l’abandon du patient pendant le processus de diagnostic.

Remerciements

Nous remercions Médecins Sans Frontières France, qui a parrainé l’étude, et les équipes de Médecins Sans Frontières à Mathare et Nairobi, qui nous ont été très favorables. Un remerciement spécial aux techniciens d’étude Thomas Agendo, Purity Muthoni Ndwiga, Andrew Mwangi Chege et Ali Abdullahi. Stéphanie Charrondière, coordinatrice de la préparation de l’étude à Mathare Nous remercions vivement le personnel du laboratoire de tuberculose de KEMRI, qui a effectué le contrôle externe de la qualité de la microscopie des frottis de crachats. Nous remercions également Laurence Bonte pour son assistance technique et Oliver Yun pour son excellent support à la rédaction de l’articleFinancement financier Médecins Sans FrontièresPerspectives d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits