Diversité moléculaire et voies de colonisation de Candida albicans dans une unité de soins intensifs chirurgicaux, étudiée à l’aide de marqueurs microsatellitaires

Pour évaluer la colonisation des espèces Candida et l’importance de la contamination croisée avec Candida albicans, nous avons analysé prospectivement des échantillons cliniques provenant de patients chirurgicaux dans l’unité de soins intensifs qui présentaient un risque élevé de colonisation de levures. Trente-six des patients ont contracté une colonisation et / ou infection nosocomiale de la levure Un total de spécimens ont été cultivés, dont% ont donné des levures Tous les isolats de C albicans récupérés chez les patients positifs au C albicans ont été génotypés Vingt-quatre génotypes différents ont été identifiés Aucun génotype systématiquement associé à une chambre ou à un temps spécifique Les isolats prélevés sur différents sites corporels de patients à différents moments présentaient des génotypes identiques L’acquisition de C albicans dans l’USI chirurgicale semble être principalement endogène Les marqueurs microsatellites devraient également être développés pour typer les espèces non albicanes Candida si leur épidémiologie diffère de t chapeau de C albicans

Parmi les levures qui ont émergé comme pathogènes fongiques majeurs ces dernières années, Candida albicans est la plus répandue dans les unités de soins intensifs chirurgicaux Dans les unités de chirurgie abdominale, certains patients présentent un risque élevé de colonisation, infection ou les deux. avec des perforations gastro-intestinales ou des fistules anastomotiques, des transplantés hépatiques et des patients atteints de pancréatite aiguë La voie d’acquisition est intéressante pour déterminer le risque de transmission nosocomiale de C albicans et, par conséquent, mettre en place des mesures préventives appropriées pour les patients Les relations génétiques entre isolats cliniques peuvent être étudiées en utilisant des empreintes génétiques avec des méthodes basées sur l’ADN Nous avons récemment développé une analyse des marqueurs microsatellites définis comme des séquences répétitives en tandem de – nucléotides Le polymorphisme du microsatellite les marqueurs sont analysés après amplification loci fic par utilisation d’amorces fluorescentes et migration dans un gel à haute résolution La fiabilité est obtenue par une procédure automatisée, c’est-à-dire qu’un séquenceur automatique est utilisé pour mesurer la longueur des allèles. Les données peuvent être informatisées et le débit de la technique est élevé Le pouvoir discriminant de la technique est très proche de, et les marqueurs sont stables sur plusieurs générations. Par conséquent, le système de typage de marqueurs microsatellites remplit plusieurs critères biologiques et techniques, tels que le polymorphisme élevé, la reproductibilité et la faisabilité. Pour évaluer la fréquence de la colonisation et / ou de l’infection de la levure et les voies de colonisation, nous avons procédé au dépistage prospectif d’échantillons cliniques prélevés chez des patients sélectionnés de notre unité chirurgicale ayant subi une chirurgie abdominale. Tous les isolats de C. albicans les patients ont été génotypés simultanément

Patients et méthodes

ion de la ventilation mécanique; présence d’un équipement de surveillance, c.-à-d. un cathéter artériel et un cathéter veineux central; l’administration d’une antibiothérapie pendant un séjour à l’USI d’une dose unique d’antibiotique n’a pas été prise en compte; et l’exigence de transfusion L’obésité a été définie comme un indice de masse corporelle de & gt ;, pour les hommes, ou & gt ;, pour les femmes Une histoire d’une perte récente de moins de ⩾% du poids corporel signifiait substantielle malnutrition protéino-calorique avaient un cancer métastatique, une hémopathie maligne ou un SIDA, selon les définitions de Le Gall et al , ou lorsque les patients recevaient des médicaments immunosuppresseurs: cyclosporine, tacrolimus ou corticostéroïdes. Études microbiologiques Autant que possible, des échantillons de culture ont été prélevés dans le sang. – des échantillons abdominaux de liquide péritonéal, de bile et d’abcès, d’aspirats trachéaux des voies respiratoires, de liquides de lavage broncho-alvéolaire, de cathéter téléscopique obstrué, de sécrétions gastriques et d’urine de tous les patients au moment de leur arrivée aux soins intensifs, ou lorsque chirurgicalement disponible De plus, dans le cadre de la surveillance de routine, de l’urine, des selles, de la peau et des tissus mous, un écouvillon ou un aspirateur Les échantillons ont été cultivés sur le milieu chromogénique Candida ID BioMérieux à ° C pour h Ce milieu est destiné à identifier rapidement C albicans. et pour détecter des mélanges de différentes espèces de Candida Toutes les colonies bleues ont été identifiées comme étant des albicans C, et les colonies blanches ont été phénotypées en utilisant l’API commerciale ATB ID C; BioMérieux et l’analyse micromorphologique sur gélose à l’extrait de riz Becton DickinsonLes patients ayant une «espèce Candida acquise aux soins intensifs» ont été définis comme des patients nouvellement colonisés et / ou infectés par Candida après avoir été hospitalisés à l’unité des soins intensifs. défini par ⩾ résultat positif de cultures de levures effectuées à partir de spécimens prélevés sur n’importe quel site corporel, indépendamment du nombre d’unités formant colonie À des fins d’étude seulement, les patients étaient considérés comme ayant une infection à Candida s’ils présentaient des abcès intra-abdominaux ou une péritonite Candida espèces, candidémie ⩾ hémoculture positive pour les espèces de Candida, ou les infections des voies urinaires Candida & gt; colonies d’espèces de Candida par millilitre d’urine avec pyurie chez un patient symptomatique Candida organismes isolés de toute zone stérile, y compris les spécimens avec des isolats bactériens simultanés, ont été considérés comme des pathogènesGénotypage de C albicans par l’analyse des marqueurs microsatellites Amplifications ont été directement effectuées sur un seul C colonie albicans clairement isolée sur les plaques d’identification de Candida, comme décrit ailleurs Trois loci, localisés sur différents chromosomes de C albicans, ont été testés et ont ensuite été dénommés “EF”, “CDC” et “HIS”, ayant été nommés après les gènes auxquels ils sont proches Les amorces ont été conçues pour amplifier les marqueurs microsatellites, et l’amorce de chaque ensemble a été marquée avec différents colorants Les produits de PCR ont été appliqués sur un gel d’acrylamide-urée de -cm de long avec une norme interne. en utilisant un séquenceur automatique Applied Biosystems, et les données ont été stockées et analysées avec le logiciel Genescan Applied Biosystems Pour la reproductibilité des résultats, une souche de référence a systématiquement été utilisée comme témoin dans chaque gel Pour chaque marqueur et pour un isolat donné, des bandes ont été observées car C albicans est diploïde et chaque marqueur testant un seul locus pénis. allèle Par conséquent, chaque isolat était caractérisé par un profil d’allèles. Les résultats étaient exprimés par le nom du locus testé et la longueur des allèles observés dans les paires de bases. Par exemple, les résultats pour un isolat donné étaient CDC -, EF – et HIS – Certains isolats peuvent être hétérozygotes pour un locus et homozygotes pour un autre Pour simplifier, une lettre de “A” à “X” a été arbitrairement attribuée à une association d’allèle donnée. Analyse statistique Les données ont été informatisées et analysées par les paquets statistiques Stat-View SAS Institut Nous avons exprimé des variables continues comme la moyenne ± SD ou comme les percentiles médian et th-si leur distribution était faussée χ les tests ont été utilisés pour comparer la proportion s et taux Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour analyser des variables continues qui n’étaient pas normalement distribuées; Nous avons utilisé la modélisation multivariée sous la forme d’une analyse des risques proportionnels de Cox pour évaluer les facteurs de risque potentiels d’acquisition des espèces de Candida dans l’unité de soins intensifs. Dans l’analyse univariée, les variables associées à l’acquisition de la colonisation de Candida et / ou infection en unité de soins intensifs et pour lesquels P & lt; ont été saisies dans le modèle Rapports de risque Les HR et les IC% ont été calculés pour tous les prédicteurs significatifs. La signification statistique a été définie comme P ⩽

Résultats

Caractéristiques des patients Pendant la période d’étude, les patients ont été admis en réanimation pour recevoir un traitement pour une pancréatite aiguë ou après une chirurgie abdominale, et n’ont pas été inclus dans l’étude parce que leur durée de séjour à l’USI était de & lt; journées; , à cause de problèmes logistiques et, parce que le médecin traitant ne les a pas inscrits dans l’étude Les caractéristiques cliniques des patients exclus étaient les suivantes: âge moyen ± SD, ± années; score moyen SAPS II ± SD, ± points; durée médiane de séjour à l’unité de soins intensifs, jours th-th centiles, – jours; et les patients décédés [%] Un total de patients a été inclus dans l’étude Les patients ont été échantillonnés pour les champignons une médiane de fois les percentiles, – et une médiane des spécimens du th percentiles, – des échantillons ont été obtenus par patient. le nombre de patients hospitalisés à l’unité de soins intensifs chaque semaine et le nombre de patients dont les cultures ont été réalisées Parmi les patients% qui ont été trouvés positifs pour Candida,% étaient positifs au moment de l’entrée dans l’étude, et les patients% acquisition de Candida en ⩾ occasion après avoir été hospitalisé à l’USI pour h Quarante-deux pour cent de ces patients d’espèces acquises de Candida au-delà de la première semaine après leur admission en USI Treize% des patients avaient des résultats transitoires positifs de cultures de levures Colonisation avec la même espèce de Candida persisté

Figure Vue largeDownload slideLe nombre de patients étudiés chaque semaine et la cinétique de la colonisation ou infection nosocomiale Candida Les barres blanches indiquent le nombre de patients hospitalisés chaque semaine Les barres rayées indiquent le nombre de patients évalués pour la colonisation Candida La courbe dénote la cinétique de la colonisation ou infection Candida Le nombre de patients étudiés chaque semaine et la cinétique de la colonisation ou de l’infection nosocomiale à Candida Les barres blanches indiquent le nombre de patients hospitalisés chaque semaine. Les barres barrées indiquent le nombre de patients évalués pour Candida. colonisation La courbe indique la cinétique de la colonisation ou de l’infection à Candida et est exprimée en pourcentage des patients positifs à Candida. Les caractéristiques cliniques des patients avec ou sans acquisition de Candida nosocomiale sont résumées dans le tableau Un modèle multivarié de Cox a été construit. les variables univariées associées à la colonisation de Candida acquise aux soins intensifs et / ou l’infection lorsque P & lt; Facteurs de risque indépendants étaient la réopération HR; % CI, -, reçu antérieur d’antibiothérapie HR,; % CI, -, et la réception de la nutrition parentérale totale HR,; % CI, –

Tableau View largeTélécharger les caractéristiques démographiques et de facteurs de risque des patients avec ou sans acquisition de Candida nosocomiale dans l’unité de soins intensifs chirurgicauxTable View largeTélécharger les diapositivesDémographiques et les facteurs de risque des patients avec ou sans acquisition nosocomiale Candida dans l’unité de soins intensifs chirurgicauxSixteen patients ont été considérés comme Six de ces patients étaient déjà infectés au moment de l’admission à l’unité de soins intensifs. Dix patients ont eu une infection nosocomiale à Candida après un séjour médian de plusieurs jours, des jours chez les patients en réanimation avaient une péritonite ou des abcès intra-abdominaux. Pour les patients, le décès était dû à une infection à Candida. 15% des patients colonisés et% des patients non colonisés ont reçu du fluconazole par voie intraveineuse. & lt; Tous les patients infectés avaient reçu du fluconazole en même temps pendant leur séjour aux soins intensifs Quatre patients ont reçu d’autres agents antifongiques pour le traitement des infections à Aspergillus ou Candida krusei Enquête microbiologique Un total de spécimens ont été examinés, dont% ont levé en culture. à partir de laquelle des échantillons positifs pour la culture ont été obtenus:% de tube digestif, de peau et de tissus mous% et de voies respiratoires% Quarante-trois patients avaient ⩾ échantillon positif C albicans isolé chez des patients seuls et en association avec d’autres espèces de Candida chez les patients Les espèces de Candida les plus fréquemment récupérées étaient C albicans de% des patients et C glabrata de% des patients Autres espèces Candida qui ont été récupérées moins fréquemment inclus C parapsilosis et C tropicalis de% des patients chacun et C krusei, C kefyr, C lypolytica , C guillermondi, et C sake à partir de% des patients Chaque espèce a été récupérée à partir de% des patients positifs

Tableau View largeDownload slideRépartition et récupération des organismes Candida à partir d’échantillons cliniques obtenus chez des patients atteints de colonisation de Candida nosocomiale View largeTélécharger la diapositiveRépartition et récupération des organismes Candida à partir de spécimens cliniques obtenus de patients atteints de colonisation nosocomiale CandidaPour les patients colonisés par et / ou infectés par C. albicans, soit seul ou en association avec d’autres espèces de Candida, l’analyse des marqueurs microsatellites a permis d’obtenir des profils de profils A-X; Comparativement à nos résultats précédents, nous n’avons pas trouvé de nouveaux allèles parmi les isolats testés, mais nous avons identifié de nouvelles associations d’allèles Les souches isolées de différents sites corporels des sites superficiels et profonds du même patient à différents moments avaient des profils identiques Lorsque l’infection a eu lieu, le génotype était identique, confirmant que le patient était bien infecté par sa propre souche colonisatrice

Figure Vue largeDownload slideRésultats du génotypage d’isolats de Candida albicans provenant de patients de l’unité de soins intensifs chirurgicaux ICU colonisés par ou infectés par C albicans Numéros – désignent les chambres des patients, qui ont été divisées en blocs B-B Les blocs alternativement fermés pendant l’étude Des bouteilles individuelles contenant une préparation à base d’alcool de gluconate de chlorhexidine étaient disponibles dans chaque chambre Pour chaque patient, le génotype déterminé par les marqueurs microsatellites est noté par une lettre de l’alphabet “A” – “X” Certains patients se sont déplacés d’une pièce à l’autre pendant l’étude Pt, patient; •, durée du séjour à l’unité de soins intensifs; * patients infectés identifiésFigure View largeTélécharger les résultatsRésultats du génotypage des isolats de Candida albicans chez des patients de l’unité de soins intensifs chirurgicaux ICU qui ont été colonisés par ou infectés par C. albicans Numéros – indiquent les chambres des patients, qui ont été divisées en blocs B-B Pendant toute la durée de l’étude, des puits ont été placés à l’intérieur de chaque bloc et des bouteilles individuelles contenant une préparation à base de gluconate de chlorhexidine à base d’alcool étaient disponibles pour chaque patient. Le génotype déterminé par les marqueurs microsatellites est indiqué par une lettre de l’alphabet. A “-” X “Certains patients se sont déplacés d’une pièce à l’autre pendant l’étude Pt, patient; •, durée du séjour à l’unité de soins intensifs; La distribution chronologique et géographique des différents profils est décrite dans la figure. Trois génotypes ont été détectés chez des patients dont aucun ne partageait une chambre Le profil I, rencontré chez les patients%, était aussi le profil le plus fréquemment rencontré parmi les isolats non apparentés. Les profils restants ont été chacun détectés chez un seul patient

Discussion

Nous avons également trouvé que la contamination croisée avec C albicans était peu probable chez la plupart des patients colonisés ou infectés. La fréquence de la colonisation par Candida a été rapportée de% à% chez les patients chirurgicaux. , des pourcentages plus élevés ont été notés , atteignant% dans une étude Soixante pour cent de nos patients Candida-positifs ont été colonisés au cours de la première semaine; Les patients colonisés avaient tendance à être plus âgés, mais l’âge avancé n’était pas identifié comme un facteur de risque, bien que la fréquence et l’intensité du transport des espèces de Candida aient augmenté avec le temps. , Dans cette population, la prophylaxie antifongique par l’amphotéricine B par voie orale semblait inefficace pour prévenir la colonisation ou l’infection par voie orale. infection par des espèces de Candida Dans notre étude, seulement% des spécimens cliniques ont développé des espèces de Candida, comparé au% de ces spécimens obtenus de patients chirurgicaux avec des perforations intra-abdominales Il est à noter que tous les échantillons d’un patient donné positif pour la levure une fois qu’un patient était positif dans notre étude, comme dans une étude publiée ailleurs en conséquence nuisible pour une étude microbiologique, certains spécimens peuvent être alternativement positifs ou négatifs, en fonction de l’ensemencement des milieux de culture. Le rôle des médicaments antifongiques et la prolifération de certaines bactéries dans l’inhibition de la croissance des cultures doivent être pris en compte résultats négatifs pour les champignons La quantification du nombre de levures n’a donc probablement pas beaucoup de sens pour la prise de décision chez ces patients. L’utilisation de la densité de colonisation et, par conséquent, le nombre de sites anatomiques à échantillonner sont toujours controversés , nous pensons que les échantillons cliniques provenant de sites corporels qui pourraient être la source de complications infectieuses potentielles, telles que les sécrétions intra-abdominales [,,], devraient au moins être obtenus chez des patients sans amélioration clinique Dans notre étude, C albicans la plupart des espèces prédominantes se sont rétablies chez% des patients, C glabrata étant la deuxième espèce la plus prévalente chez% des patients, comme indiqué re [,,], justifiant notre choix de se concentrer sur C albicans dans un premier temps La fréquence de chaque génotype n’était pas significativement différente de celle obtenue à partir d’isolats non apparentés, y compris les souches de référence Le fait que certains génotypes étaient plus fréquents que d’autres qu’aucun allèle n’était associé à un site anatomique spécifique ou qu’un effet pathogène avait déjà été observé dans un hôpital complètement différent en utilisant la même méthode de prise d’empreinte Bien que l’acquisition exogène de Candida soit possible , et bien que les organismes Candida puissent être transmis Dans la présente étude, la majorité des infections à C. albicans semblent provenir d’une source endogène. L’évidence d’une source endogène d’infection à levures repose sur plusieurs arguments. Premièrement, sur un site anatomique donné, la colonisation. avec la même souche de C albicans persistait chez tous les patients, confirmant les résultats d’études précédemment publiées Troisièmement, à un moment donné, la souche d’un seul patient a été isolée à partir de plusieurs sites anatomiques Quatrièmement, la prolifération de la levure entraîne généralement la survenue de l’infection. des altérations des défenses de l’hôte, observées après un traitement antibactérien prolongé, confirmé comme facteur de risque dans notre étude Enfin, l’analyse de la répartition génotypique ne permettait pas la transmission nosocomiale. Aucun génotype n’était systématiquement associé à une pièce spécifique ou à un Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que les patients qui sont restés dans le service de chirurgie pour & lt; En conclusion, nos résultats suggèrent fortement que l’acquisition de C albicans est principalement, peut-être seulement, endogène. Par conséquent, dans l’USI, les efforts doivent être axés sur les endogènes. l’acquisition, en supposant que les mesures actuelles de prévention de la transmission croisée des microorganismes sont correctement suivies Ceci peut être basé sur un dépistage régulier des patients à haut risque, comme suggéré précédemment , pour mettre en œuvre des stratégies préventives déjà suivies Les marqueurs microsatellites devraient également être développés pour le typage d’autres levures médicalement importantes, telles que C glabrata et C parapsilosis. L’émergence d’espèces non albicans Candida a été attribuée à l’utilisation croissante de médicaments azolés , et la propagation de ces espèces peut être différent de celui de C albicans

Remerciements

Nous remercions les infirmières et les médecins du service de chirurgie pour leur contribution à l’étude