Inhibition de la protéine hématopoïétique La tyrosine phosphatase par les acides phénoxyacétiques

La phosphorylation de la tyrosine est un mécanisme clé de la transduction du signal.Des anomalies des protéines tyrosine kinases (PTK) et des protéines tyrosine phosphatases (PTP) ont été rapportées dans de nombreuses maladies humaines héréditaires ou acquises1. Bien que le développement d’inhibiteurs spécifiques de la PTP reste une tâche difficile, de nombreux exemples de cellulo et in vivo ont été rapportés, offrant des opportunités pour de nouvelles stratégies de traitement du cancer, ainsi que des maladies métaboliques et immunologiques.3 − 7La protéine tyrosine phosphatase (HePTP) 8,9 est une enzyme de 38 kDa exprimée dans la moelle osseuse, le thymus , rate, ganglions lymphatiques, et toutes les lignées myéloïdes et lymphoïdes et les lignées cellulaires.8 − 10 Le gène HePTP ptpn7 est situé sur le chromosome 1q3211 et est souvent dupliqué dans les cellules de la moelle osseuse des patients atteints du syndrome myélodysplasique, 12,13 qui est caractérisé par hématopoïèse perturbée et un risque accru de leucémie aiguë. L’amplification et la surexpression de HePTP ont également été rapportées dans la leucémie myéloïde aiguë (AML) .11 La protéine HePTP est constituée d’un domaine tyrosine phosphatase et d’une courte extension N-terminale, qui contient une région appelée motif d’interaction kinase (KIM). Les substrats physiologiques de HePTP comprennent les kinases extracellulaires régulées par le signal 1/2 (ERK1 / 2) et la protéine kinase activée par un mitogene p38 (MAPK), qui s’associe étroitement à HePTP via le KIM. Dans les lymphocytes T au repos, HePTP assure la déphosphorylation du résidu phosphotyrosine (pTyr) régulateur positif dans la boucle d’activation des kinases14,15 et empêche également leur translocation vers le noyau.17 La ligature du récepteur d’antigène des cellules T (TCR) produit non seulement activation de la MAPK mais aussi de la phosphorylation de HePTP à Ser-23 par la kinase AMPc dépendante, provoquant la dissociation du complexe HePTP-MAPK.15,18 Une fraction de ERK / p38 activée est alors capable de translocation vers le noyau, initiant des événements de signalisation qui conduisent à l’activation des lymphocytes T.18 De petits inhibiteurs de PTP impliqués dans la régulation cytosolique MAPK ont été rapportés pour la phosphatase liée à la vaccine H1 (VHR) 19 et la MAP kinase phosphatase-3 (MKP-3). 22 Les deux enzymes, avec HePTP, partagent la cible physiologique commune ERK. Cependant, les modulateurs spécifiques de l’activité HePTP n’ont pas encore été décrits. Ici, nous rapportons la découverte d’une série d’acides phénoxyacétiques en tant qu’inhibiteurs de HePTP. Nous montrons que ces composés sont capables de pénétrer dans les membranes cellulaires et inhiber HePTP dans les cellules T humaines et de fournir des preuves de la façon dont ces inhibiteurs interagissent avec HePTP sur un niveau moléculaire. Nous discutons également de la spécificité de ces inhibiteurs pour HePTP versus les phosphatases apparentées VHR et MKP-3.Pour identifier les inhibiteurs de la phosphatase VHR, nous avons récemment réalisé un criblage à haut débit (HTS) en utilisant le réseau des centres de production de sondes de bibliothèques moléculaires (MLPCN, http://mli.nih.gov/mli/mlpcn/). HePTP et MKP-3 ont été utilisés pour les contre-écrans, ce qui nous a conduit à la découverte des inhibiteurs sélectifs de HePTP décrits ici. Dans le HTS primaire, la collection MLPCN de 291018 composés a été criblée en utilisant un dosage de la phosphatase colorimétrique, 23 résultant en 1524 actifs, c’est-à-dire des composés qui ont démontré une inhibition de VHR de 50% à une concentration de 13,3 &#x003bc M. Les résultats détaillés de la sélection ont été téléchargés sur le site Web de PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/; AID 1654). Les dosages secondaires de la concentration unique et de la dose ont utilisé le phosphate de 3-O-méthylfluorescéine (OMFP) à base de fluorescéine. Ces essais ont confirmé que 195 résultats inhibaient la VHR d’une manière dépendante de la dose (PubChem AIDs 1878 et 1957). Les résultats confirmés ont ensuite été testés dans des tests de contre-dépistage contre HePTP et MKP-3, en utilisant le même substrat OMFP. Étonnamment, nous avons identifié un échafaudage composé qui a montré une activité plus puissante vers HePTP que vers VHR ou MKP-3 (tableau 1). Cet échafaudage contenait une structure de noyau 2H-thiazolo [3,2-a] pyrimidin-3 (5H) -one et un groupe de tête d’acide phénoxyacétique. La structure subséquente et l’analyse de la relation d’activité (SAR) ont révélé que le groupe acide phénoxyacétique de ces composés était essentiel pour l’inhibition de la PTP, probablement en imitant le groupe tyrosine phosphate du substrat naturel. L’analogue 6, qui ne contient pas le groupe acide phénoxyacétique, n’inhibe pas l’un quelconque des trois PTP à une concentration de 50 ° M. Nous avons également trouvé que le motif de substitution au niveau du cycle phényle en position 5 de l’hétérocycle thiazolo-pyrimidinone modifiait l’activité inhibitrice des composés. Les inhibiteurs avec de petits substituants, tels qu’un atome de chlore en position para (composés 1 et 2), ont donné de meilleurs résultats contre HePTP. En fait, le composé 1 était l’inhibiteur le plus sélectif pour HePTP, présentant une sélectivité de 19,5 fois par rapport à la VHR et une sélectivité de 42 fois par rapport à MKP-3.Pour évaluer la sélectivité de 1 dans un contexte plus large de PTP spécifiques à la tyrosine comme HePTP, nous avons effectué des expériences supplémentaires en utilisant un test de phosphatase standard et un panel de six PTP recombinants qui sont également présents dans les cellules T. Dans ces expériences, nous avons trouvé que le composé 1 inhibe sélectivement HePTP sur CD45 (8,8 fois), Shp2 (4,1 fois), TCPTP (2,6 fois), Lyp (1,4 fois), LAR (> 50 fois ), et également PTP1B (4,3 fois). En outre, Michaelis − études cinétiques Menten a révélé que le composé 1 est un inhibiteur compétitif avec un Ki de 0,69 ± 0.20 μ M pour HePTP.Table 1In Vitro Profil d’activité des inhibiteurs contre les phosphatases HePTP, VHR et MKP-3Pour comprendre comment les acides phénoxyacétiques inhibent HePTP au niveau moléculaire, nous avons utilisé in silico docking pour explorer les modes de liaison potentiels de ces inhibiteurs avec HePTP. L’amarrage de ligand flexible a été réalisé avec l’algorithme d’amarrage ICM tel que mis en œuvre dans le programme ICM-Pro (v3.7-1g, Molsoft, LLC). Les coordonnées de la structure tridimensionnelle (3D) de HePTP en complexe avec un peptide phosphorylé correspondant à la boucle d’activation ERK ont été utilisées pour les études d’amarrage (code PDB 3D44, ref (24)). La poche de liaison dans HePTP a été définie comme 8 Å rayon autour du résidu pTyr du phosphopeptide. Parce que tous les inhibiteurs étaient des mélanges racémiques contenant à la fois des énantiomères R et S à un rapport de 50:50, les scores d’amarrage ICM ont été calculés pour chaque isomère (tableau 2). Structures (R) -1, (R) -2, (R) -3, (R) -5, (S) -1, (S) -2, (S) -3 et (S) -4 amarrées dans le site actif HePTP avec de très bons scores (− 34) à excellents (− 65) (Tableau 2, les scores en dessous de − 32 sont généralement considérés comme des sons). Inversement, les structures (R) -4, (R) -6, (S) -5 et (S) -6 ne sont pas ancrées avec des scores raisonnables et, en fait, ne sont pas capables de se lier dans la poche catalytique. La corrélation de ces résultats d’amarrage avec les valeurs de CI50 pour HePTP obtenues à partir des mélanges racémiques des composés (Tableau 1) suggère que les inhibiteurs se répartissent en trois groupes. Dans le premier groupe (composés 1, 2 et 3), les deux énantiomères R et S sont très bien ancrés dans le site actif, tout en présentant également des valeurs IC50 très faibles, suggérant que les deux énantiomères inhibent HePTP. Dans le second groupe (composés 4 et 5), les scores d’amarrage variaient substantiellement pour les énantiomères individuels malgré les faibles valeurs de CI50 présentées par les composés, suggérant qu’un seul isomère inhibait l’activité de HePTP dans le test biochimique. Dans le groupe 3 (composé 6), les deux énantiomères échouaient à s’ancrer dans HePTP, compatible avec l’absence totale d’activité inhibitrice pour ce composé. Les scores d’ancrage 2ICM des stéréoisomères inhibiteurs avec HePTP, VHR et MKP-3To explorent si la sélectivité observée des inhibiteurs de HePTP sur VHR et MKP-3 pourrait être expliqué sur la base des différences structurelles dans les sites actifs des trois enzymes, nous avons également ancré les composés dans les structures cristallines de VHR (code PDB 1J4X) et MKP-3 ( Code PDB 1MKP). Bien que tous les composés n’aient pu s’ancrer dans MKP-3, la majorité des composés pourraient être ancrés dans le centre catalytique de la VHR, bien qu’avec des scores d’amarrage significativement plus bas que ceux de HePTP (Tableau 2). Ainsi, comme on l’a vu pour HePTP, les résultats de l’amarrage ligand flexible sont très bien corrélés avec les données du test biochimique, dans lequel une activité inhibitrice faible ou nulle a été observée vers MKP-3, et une activité inhibitrice modérée a été observée vers VHR. ces composés peuvent interagir avec des résidus sur le site actif HePTP. SAR a démontré que le groupe acide phénoxyacétique est critique pour l’inhibition. En effet, dans tous les composés amarrés avec succès, ce groupe a formé de multiples liaisons hydrogène avec des résidus multiples dans la poche catalytique HePTP, imitant parfaitement la liaison d’un fragment phosphate (figure ​ (figure1) .1). Plus précisément, des liaisons hydrogène ont été formées entre les azotures de guanidinium et l’azote du squelette de l’invariant Arg-276 de la boucle de liaison au phosphate (boucle P), l’azote de squelette de His-237 de la boucle WPD et la chaîne latérale de le Gln-314 conservé de la boucle Q. En outre, le cycle phényle du groupe acide phénoxyacétique a été impliqué dans π − π interactions d’empilement avec Tyr-104 de la boucle de liaison au substrat (boucle SB), qui n’est pas présente dans MKP-3 ou VHR. D’un point de vue critique, les inhibiteurs se sont également avérés interagir avec deux autres résidus de la boucle SB, Lys-105 et Thr-106 (figure ​ (figure1) .1). Dans toutes les molécules ancrées avec succès, le groupe ε -amino de Lys-105 et / ou le groupe hydroxyle de Thr-106 ont formé une liaison hydrogène avec l’atome d’oxygène du groupe ester dans la position 6 de l’hétérocycle. Ni Lys-105 ni Thr-106 sont conservés dans VHR ou MKP-3 (la boucle correspondante contenant ces résidus est manquante dans MKP-3 et beaucoup plus courte dans VHR), suggérant que ces interactions peuvent contribuer à l’inhibition sélective de HePTP.En fait, un résidu thréonine en position 106 est seulement trouvé dans les trois PTP contenant KIM, 25 y compris HePTP, la phosphatase enrichie en striatum (STEP), et le PTP de type STEP (PTP-SL / PCPTP1), les deux derniers de qui ne sont pas exprimées dans les cellules T car elles sont exprimées principalement dans le cerveau.24 Pour donner une preuve supplémentaire d’un tel mode de liaison dans lequel l’inhibiteur interagit spécifiquement avec ces deux résidus, nous avons utilisé la mutagenèse dirigée pour muter Lys-105 et Thr -106 à des alanines et testé le composé 1 contre le double mutant HePTP recombinant. En utilisant le phosphate de 6,8-difluoro-4-méthylumbelliféryle (DiFMUP) comme petit substrat artificiel, les paramètres cinétiques incluant Km et Vmax étaient similaires entre protéine sauvage et protéine mutante, ce qui nous a permis de comparer directement les valeurs IC50 de l’inhibiteur. De manière intéressante, le composé 1 était 2,1 fois moins actif contre l’enzyme mutante K105A / T106A, démontrant clairement que les deux résidus sont impliqués dans la liaison de l’inhibiteur. Le fait que la différence d’inhibition soit modeste est probablement dû à des interactions hydrophobes favorables entre le groupe ester éthylique du composé 1 et les groupes méthyle des résidus alanine mutés dans HePTP. Pris ensemble, nos études computationnelles ont révélé des détails moléculaires sur un mode de liaison possible pour les acides phénoxyacétiques avec HePTP, ainsi que des interactions qui peuvent conférer la sélectivité de ces composés pour HePTP. Fait important, les résultats obtenus à partir des études d’amarrage étaient en excellent accord avec les données biochimiques, y compris les études de mutagenèse. Figure 1In silico amarrage des énantiomères d’acide phénoxyacétique dans le site actif HePTP (code PDB 3D44). Panneau supérieur: Représentation en surface des résidus du site actif HePTP avec les composés ancrés (R) -1 (blanc), (R) -2 (jaune clair), (R) -3 (orange), (R) -5 (bleu), … Pour évaluer la capacité de ces composés à inhiber l’activité HePTP dans des cellules humaines intactes, nous avons effectué des dosages à base de cellules T pour sonder les sites de phosphorylation dans les substrats directs de HePTP. Pour les tests d’immunoblot, nous avons pré-incubé les cellules T Jurkat avec le composé 1 ou 2 à des concentrations de 5 et 40 ° C ou de véhicule (DMSO) à 37 ° C pendant 45 minutes. Les cellules ont ensuite été stimulées par TCR pendant 5 minutes et les réactions ont été stoppées par l’ajout d’un tampon de lyse. L’immunoblot a été réalisé avec des anticorps spécifiques phospho-ERK1 / 2 (pERK) et phospho-p38 (pp38). L’activation de la kinase C-Jun N-terminale (JNK), qui est une cible pour VHR mais pas pour HePTP, a été mesurée pour évaluer la spécificité des inhibiteurs dans les cellules. Les résultats montrent que les deux composés 1 et 2 à des concentrations de 5 et 40 μ M ont augmenté les niveaux de pp38, tandis que les niveaux de pJNK n’ont pas été affectés (Figure2; 2, comme on peut le voir, les niveaux pp38 augmentent en présence d’inhibiteur), l’effet était plus grand à 40 μ M, ce qui démontre une efficacité dose-dépendante des deux inhibiteurs.En particulier, les composés n’ont pas augmenté l’activation de ERK, suggérant redondances dans la déphosphorylation de ERK par MKP-3 et / ou VHR, les deux autres PTP connus pour agir sur ERK à ce stade précoce de la signalisation du TCR Etant donné que MKP-3 était considérablement moins ou pas inhibé par les composés dans la dosage de la phosphatase et que l’activité de VHR n’était pas affectée dans les cellules (mesurée par les taux de pJNK inchangés), la redondance dans la désactivation de ERK par ces deux PTP semble probable et expliquerait les résultats observés. 80% a déjà été montré pour augmenter les niveaux de pERK De manière importante, nous avons démontré que les inhibiteurs de l’acide phénoxyacétique étaient capables de pénétrer dans les membranes cellulaires et d’inhiber HePTP dans les cellules. De plus, ces données suggèrent qu’il est en effet possible de moduler sélectivement la voie p38 MAPK avec ces petites molécules. Les lymphocytes T traités avec l’analogue inactif 6 n’ont montré aucun changement dans l’activation de MAP kinase, montrant que la phosphorylation de p38 augmentée par les composés 1 et 2 n’est pas due à des effets non spécifiques (données non montrées). Cellules T Les cellules ont été incubées avec le véhicule (DMSO, 0,2%) ou les composés racémiques 1 ou 2 à 5 ou 40 ° C pendant 45 minutes à 37 ° C avant la stimulation par TCR avec OKT3 pendant 5 minutes. Cellule … En conclusion, nous avons identifié une série d’inhibiteurs spécifiques de HePTP avec de faibles activités micromolaires in vitro et dans les cellules. L’analyse SAR a révélé que le groupe acide phénoxyacétique était essentiel pour l’activité inhibitrice des composés, suggérant que ce groupe imite le pTyr du substrat naturel. En effet, des études in silico docking ont montré que ce groupe interagit fortement avec la boucle P dans la poche catalytique de HePTP.Ces études, en combinaison avec des expériences de mutagénèse, ont également identifié des interactions favorables des composés avec les résidus moins conservés Lys-105 et Thr-106 dans la boucle HePTP SB et supportent la stratégie d’inhibition sélective de la PTP via les interactions protéine / ligand. à la poche catalytique.23,27,28 Le fait que les scores d’amarrage variaient substantiellement entre les différents énantiomères pour certains des inhibiteurs indique que des études futures avec des composés énantiomériquement purs sont justifiées et seront importantes pour une optimisation ultérieure des composés. Il indique également que les valeurs de CI50 pour les composés énantiomériquement purs sont probablement inférieures à celles rapportées. Fait important, nous avons trouvé que les inhibiteurs de l’HePTP étaient actifs dans les lymphocytes T à des concentrations aussi faibles que 5 μ M. Ces tests ont également démontré qu’aux concentrations testées, les composés n’inhibaient pas la VHR dans les cellules. En fait, nous avons observé un effet spécifique sur l’activation de p38, alors que le substrat pERK n’était pas affecté. Ainsi, ces composés seront utiles pour moduler spécifiquement la signalisation de p38, tandis que la signalisation à travers la voie Ras-Raf-MEK-ERK ne sera pas affectée. Des études ultérieures avec ces composés permettront d’établir si l’inhibition pharmacologique de HePTP fournira des traitements pour divers troubles (pré) -leucémiques.