Test de sensibilité aux mycobactéries

Les tests de susceptibilité mycobactérienne sont importants pour la prise en charge des patients atteints de tuberculose et ceux atteints de certaines mycobactéries non tuberculeuses Pour aider à standardiser les méthodes utilisées dans le laboratoire de microbiologie clinique pour tester la sensibilité des mycobactéries, le Comité national des normes de laboratoire clinique publié dans, qui est la norme provisoire pour les tests de susceptibilité antimycobactérienne de Mycobacterium tuberculosis La deuxième édition du document standard provisoire NCCLS MT diffère considérablement du document initial Il contient des directives révisées pour les tests du complexe M tuberculosis et les nouvelles directives proposées pour les tests de certaines mycobactéries non tuberculeuses, y compris Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae et Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii et Mycobacterium marinum, ainsi que Nocardia les espèces et autres actinomycètes aérobies Les recommandations pour les tests de susceptibilité mycobactérienne qui sont décrites dans le document N-MCC M-T sont passées en revue

Les tests de sensibilité aux mycobactéries sont importants pour la prise en charge appropriée des patients. Ils doivent être réalisés sur des isolats initiaux de Mycobacterium tuberculosis chez tous les patients et sur des isolats cliniquement significatifs de certaines mycobactéries non tuberculeuses. NTM En général, lorsqu’un test de sensibilité aux antimicrobiens est réalisé en laboratoire clinique, d’une méthode normalisée recommandée par le Comité national pour les étalons de laboratoire cliniques NCCLS est optimal Pour les bactéries non parasitaires qui se développent en aérobiose, par exemple, Staphylococcus aureus et Escherichia coli, de telles directives NCCLS sont disponibles depuis des années pour les mycobactéries. En, le NCCLS a publié son premier document pour les tests de susceptibilité mycobactérienne, le document MT, qui est une norme provisoire qui traite uniquement de la tuberculose M. La deuxième édition de ce document provisoire de la norme NCCLS MT a été récemment élaborée. En plus des recommandations proposées pour le test de certains MNT et des actinomycètes aérobies Dans ce rapport, je passe en revue les recommandations pour les tests de susceptibilité mycobactérienne qui sont décrites dans le document N-MLS M-T

MTBC

Les méthodes généralement utilisées aux États-Unis pour les tests de sensibilité au MTBC sont basées sur la capacité de l’isolat en cours d’évaluation à croître sur de la gélose ou dans un bouillon contenant une seule concentration «critique» d’un médicament. la concentration la plus faible qui inhibe les souches «sauvages», c’est-à-dire les isolats qui n’ont jamais été en contact avec des médicaments antituberculeux mais n’inhibe pas les isolats de patients qui ne répondent pas cliniquement au traitement. Les tests de susceptibilité aux États-Unis, et le NCCLS a récemment proposé qu’il soit utilisé comme méthode de référence pour tous les médicaments sauf un L’exception est le pyrazinamide, pour lequel BACTEC TB BD Biosciences, Sparks, MD est la méthode de référence proposée En utilisant la proportion d’agar, la définition de la résistance est basée sur le fait que la thérapie est moins susceptible d’être cliniquement réussie lorsque% de la population bactérienne testée in vitro est résistante Bien que la proportion de gélose soit la méthode de référence proposée par rapport à laquelle la performance de nouvelles méthodes doit être comparée, le Sous-comité NCCLS sur les tests de sensibilité antimycobactérienne reconnaît que, en général, Le sous-comité NCCLS recommande aux laboratoires d’utiliser une méthode rapide de test de sensibilité pour atteindre l’objectif proposé par les Centers for Disease. Contrôle et prévention [CDC] de la déclaration des résultats des tests de sensibilité MTBC dans les jours suivant la réception d’un échantillon au laboratoire La méthode rapide recommandée consiste à utiliser des systèmes commerciaux à base de bouillon qui ont été approuvés par le US Food and Administration des médicaments FDA Deux systèmes approuvés par la FDA sont actuellement disponibles: la BACTEC TB radiométrique ch est la méthode la plus fréquemment utilisée pour les tests de sensibilité de MTBC aux États-Unis, et le plus récemment introduit ESP Culture System Trek Diagnostics, Westlake, OH Autres systèmes de bouillon ont été évalués et devraient être disponibles dans Pour les médicaments qui n’ont pas été approuvés par la FDA pour les tests avec des systèmes commerciaux, la méthode standard de dosage en agar doit être utilisée. Les principaux médicaments recommandés par le sous-comité NCCLS pour les tests de MTBC sont l’isoniazide aux concentrations et la rifampine, éthambutol Cette combinaison d’agents a été choisie pour fournir des informations complètes sur la pharmacothérapie initiale actuellement recommandée pour le traitement de la plupart des patients atteints de tuberculose aux États-Unis. Les médicaments antituberculeux secondaires utilisés pour les tests sont la capréomycine, la cyclosérine, l’éthionamide, la kanamycine, l’ofloxacine, l’acide para-aminosalicylique, la rifabutine et la streptomycine. les concentrations de certains médicaments testés sont différentes, selon la méthode ou le milieu utilisé; les médicaments qui sont recommandés pour être testés en utilisant la méthode des proportions d’agar sont listés dans le tableau Tous ces médicaments secondaires, à l’exception de la cyclosérine, plus une concentration plus élevée d’éthambutol doivent être testés pour tout isolat résistant à la rifampine ou est résistant aux médicaments primaires Cycl La cyclosérine reste une option thérapeutique, mais les tests in vitro ne sont pas recommandés en raison des problèmes techniques associés au test.

Tableau View largeTélécharger slideMédicaments antituberculeux et leurs concentrations recommandées pour les tests au moyen de la méthode agar proportionTable View largeTélécharger les diapositivesMédicaments non tuberculeux et leurs concentrations recommandées pour les tests au moyen de la méthode agar proportionLes laboratoires publics et provinciaux de santé publique servent de centres de référence pour les tests mycobactériens. fournir – ou assurer – l’accès aux tests de sensibilité du MTBC contre l’ensemble des médicaments antituberculeux primaires, ainsi que contre les médicaments secondaires, lorsque cela est indiqué dans d’autres laboratoires, cependant, la modification du panel recommandé de médicaments antituberculeux primaires peut être appropriée. les systèmes hospitaliers rapides et commerciaux recommandés sont chers. Par conséquent, dans les communautés où la résistance au pyrazinamide seul est rarement ou jamais rencontrée, l’essai d’un panel réduit d’isoniazide, la rifampicine, et l’éthambutol peut être une alternative économique qui fournirait suffisamment d’informations pour la gestion du patient. Si un tel protocole était adopté, le pyrazinamide serait testé seulement si l’isolat était résistant à un ou plusieurs des autres agents primaires. avec les maladies infectieuses et les spécialistes pulmonaires Les facteurs à prendre en compte dans le processus décisionnel comprennent la population de patients desservie, la prévalence de la pharmacorésistance dans la communauté, l’accès à d’autres tests en cas de pharmacorésistance ou d’intolérance, le délai d’exécution ], et les schémas thérapeutiques locaux recommandés par les responsables du contrôle antituberculeux préconisés par le CDC, des tests de sensibilité doivent être effectués sur le premier isolat de MTBC obtenu chez chaque patient Les tests doivent être répétés si le patient a encore une culture positive résultat après des mois de traitement approprié ou si le le patient ne répond pas cliniquement à la thérapieEn ce qui concerne la communication des résultats, le sous-comité des NCCLS suggère que les laboratoires déclarent au minimum à la fois le nom du médicament testé et une interprétation du résultat, par exemple «sensible», «résistant» ou «limite résistante» [la dernière catégorie s’applique uniquement au pyrazinamide] Dans le cas de l’isoniazide, pour lequel l’essai des concentrations est recommandé, si un isolat résiste à la concentration critique μg / mL mais est sensible à la concentration plus élevée μg / Les résultats indiquent que les patients infectés par des souches présentant ce niveau spécialiste dans le traitement de la tuberculose devrait être consulté sur le régime thérapeutique approprié et les dosages “Laboratorie s peuvent également choisir de rapporter les concentrations de médicaments utilisées pour les tests. Si elles notifient les concentrations, le laboratoire doit également spécifier le milieu d’essai, la méthode d’essai utilisée et la méthode de référence équivalente. Pour les laboratoires utilisant la méthode de référence Si les médicaments sont testés à des concentrations autres que les concentrations critiques ou à leurs concentrations équivalentes pour des méthodes autres que la méthode de référence de la proportion gélosée, la concentration et la méthode, ou la méthode de référence, les concentrations équivalentes doivent être spécifiées

NTM en croissance lente

À l’heure actuelle, il existe suffisamment de données sur lesquelles fonder des recommandations générales pour les tests de sensibilité de certaines MNT à croissance lente, à savoir le complexe Mycobacterium avium [MAC], Mycobacterium kansasii et Mycobacterium marinum. Les agents antimicrobiens recommandés par le sous-comité NCCLS L’ATS de l’American Thoracic Society en matière de thérapie appropriée Cependant, les données actuelles sont insuffisantes pour répondre adéquatement à toutes les questions relatives aux tests de sensibilité.Plusieurs autres MNT à croissance lente peuvent provoquer des maladies chez l’homme. Les critères ATS actuels pour la détermination de la signification clinique de n’importe quelle MNT des échantillons respiratoires sont des résultats d’échantillons d’expectorations positives / de lavage bronchique avec des résultats de frottis négatifs. pour les bacilles acido-résistants A FB ou résultats de culture positifs et résultat de frottis positif Alternativement, si seul lavage bronchique est disponible, et qu’il a un résultat de culture positif ou un résultat de frottis AFB de grade ⩾, l’ATS considère que cela suffit pour établir la signification clinique. qui ont un résultat négatif de frottis de BAAR et / ou contiennent un faible nombre d’organismes sont peu susceptibles d’être cliniquement significatifs. Pour Mycobacterium terrae / nonchromogenicum, Mycobacterium xenopi et Mycobacterium simiae, les médicaments primaires et secondaires et les concentrations suggérées dans la section sur M kansasii doivent être testés. , et les mêmes lignes directrices d’interprétation devraient être utilisées Cependant, trop peu d’isolats ont été étudiés pour recommander une méthode spécifique pour ces espèces. De même, pour les mycobactéries exigeantes Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium genavense, Mycobacterium malmoense et Mycobacterium ulcerans, trop peu est actuellement connu pour recommander une méthode standard de susceptibilité le test de Mycobacterium gordonae est rarement cliniquement significatif; par conséquent, les tests de sensibilité sont rarement nécessaires

MAC

Actuellement, les lignes directrices universellement acceptées concernant les indications pour les tests de susceptibilité de MAC n’existent pas. Cependant, les chercheurs qui ont une vaste expérience avec MAC ont recommandé que les isolats suivants soient testés : Isolats cliniquement significatifs provenant de patients recevant un traitement antérieur aux macrolidesIsolates Les isolats provenant soit de prélèvements sanguins ou tissulaires de patients atteints d’une maladie disséminée, soit d’échantillons respiratoires cliniquement significatifs provenant de patients atteints d’une maladie pulmonaire sont utilisés pour déterminer si des patients ont présenté une rechute. établir des valeurs de référence. Sinon, si les tests de base ne sont pas effectués, l’isolat doit être conservé pour de futurs tests, si nécessaire. Les experts suggèrent également que si le patient ne montre aucune amélioration clinique ou présente une détérioration clinique et a toujours Les tests de sensibilité doivent être répétés après des mois, chez les patients atteints d’une maladie disséminée et après des mois chez les patients atteints d’une maladie pulmonaire chronique. Si aucun test de référence n’a été réalisé, les isolats initiaux et récents doivent être testés. et la réponse clinique a été démontrée dans un essai clinique contrôlé utilisant uniquement un macrolide . Par conséquent, l’azithromycine et la clarithromycine sont les seuls médicaments pour lesquels la susceptibilité de MAC devrait être évaluée Les résultats pour la clarithromycine prédisent ceux pour l’azithromycine problématique en raison d’une solubilité médiocre aux concentrations élevées de médicament devant être utilisées En ce qui concerne les autres agents utilisés pour traiter la MAC, aucun essai clinique prospectif n’a évalué les résultats des tests de sensibilité in vitro et les résultats cliniques. Données d’une étude rétrospective n’a montré aucune corrélation entre les résultats de l’éthambutol, Tests de sensibilité à la rifampicine et à la clofazimine et résultats thérapeutiques Les tests de susceptibilité à l’AMC doivent être effectués au moyen d’une méthode à base de bouillon: macrodilution, par exemple, méthode radiométrique BACTEC TB ou dilution par microtitrage . Préparer avec des colonies transparentes, si elles sont présentes Différents chercheurs sont actuellement en désaccord sur la valeur optimale du pH à utiliser pour tester les macrolides, qui, in vitro, sont plus actifs dans des conditions légèrement alcalines que dans des conditions légèrement acides. Parce que pour le moment il n’y a pas de données sans équivoque pour soutenir la supériorité d’un pH par rapport à un autre, les lignes directrices NCCLS indiquent que la sensibilité des isolats de MAC aux macrolides dans le bouillon est testée à l’une ou l’autre des valeurs de pH est acceptable, à condition que des recommandations pour l’interprétation du tableau des points de rupture soient suivies

Tableau View largeTélécharger la diapositiveInterpretive breakpoints pour Mycobacterium avium complexTable Voir grandDisque de téléchargementInterpretive breakpoints pour Mycobacterium avium complexFor soit la méthode, la valeur MIC et une interprétation du résultat de test, qui sont basées sur les points de cassure répertoriés dans le tableau, doivent être signalés Ces critères d’interprétation sont basés En partie, tous les isolats MAC de type sauvage sont sensibles aux macrolides, mais ils développent une résistance telle que définie par les tests in vitro comme indiqué dans le tableau après quelques mois de macrolide en monothérapie et peut développer une résistance avec une polythérapie Plus de% des isolats MAC qui démontrent une résistance aux macrolides in vitro ont acquis une mutation ponctuelle dans le domaine V du gène S rRNA Par conséquent, une résistance cliniquement significative peut être définie comme un MIC de clarithromycine de & gt ; μg / mL à un pH de ou un CMI de & gt; μg / mL à un pH de – ou une CMI azithromycine de & gt; En outre, une réponse clinique et microbiologique positive peut être attendue si la CMI de la clarithromycine est de ⩽ μg / mL pour les tests effectués à un pH de ou si la CMI est de ⩽ μg / mL à un pH de – ou Si la CMI de l’azithromycine est de ⩽ μg / mL à un pH de 25% Il est hautement improbable que les souches sauvages non traitées de MAC soient intermédiaires ou résistantes aux macrolides, le sous-comité NCCLS recommande aux laboratoires de ne pas rapporter de tels résultats. jusqu’à ce que l’identité de l’isolat soit confirmée, ou les deux Un résultat intermédiaire confirmé peut suggérer que le patient a une population mixte d’organismes MAC et devrait donc être suivi pour la résistance émergente

M kansasii

Les agents antituberculeux couramment utilisés pour traiter les infections à M kansasii sont la rifampine, l’éthambutol et l’isoniazide. Bien que ces médicaments soient généralement cliniquement actifs contre les souches non traitées, un échec du traitement peut survenir Dans pratiquement tous ces cas, l’isolat démontre une résistance in vitro à la rifampicine. Par conséquent, chez les patients pour lesquels la thérapie échoue ou pour ceux qui ont une mauvaise réponse au traitement initial, un test de sensibilité doit être effectué Souches sauvages non traitées de M kansasii en général, et, parfois, à l’isoniazide, à l’éthambutol ou aux deux. Par contre, ils sont résistants à la concentration critique d’isoniazide μg / mL pour la méthode de la proportion de gélose et montrent une sensibilité variable à la concentration plus élevée μg / mL, bien que l’isoniazide apparaisse être cliniquement actif in vivo Par conséquent, parce que les résultats in vitro ne sont pas corrélés avec Comme l’échec du traitement est toujours associé à la résistance à la rifampicine et que les laboratoires ne reçoivent généralement pas d’information sur le traitement, le sous-comité ATS et le NCCLS recommandent que tous les Les isolats de M kansasii peuvent être testés pour la sensibilité à la rifampicine seulement Les isolats peuvent être testés soit par la méthode de dosage en agar décrite pour MTBC ou par une méthode à base de bouillon qui donne des résultats comparables Les tests de susceptibilité doivent être répétés Après des mois de traitement approprié Les isolats sensibles à la rifampicine sont également sensibles à la rifabutine. Il n’est donc pas nécessaire de tester la sensibilité à ce dernier médicament chez les patients infectés par le VIH et traités par des inhibiteurs de la protéase. , le sous-comité NCCLS suggère de tester la rifabutine et μg / mL, éthambutol μg / mL, isoniazide μg / mL, streptomycine μg / mL, clarithromycine μg / mL, agent de classe pour les nouveaux macrolides, amikacine μg / mL, ciprofloxacine μg / mL, agent de classe pour les fluoroquinolones plus récentes et triméthoprime-sulfaméthoxazole TMP -SMZ ou sulfaméthoxazole μg / mL Dans les cas individuels pour lesquels des tests de sensibilité au M kansasii résistant à la rifampicine semblent indiqués, les isolats doivent être envoyés à un laboratoire de référence expérimenté

M marinum

D’abord, l’espèce est constamment sensible à plusieurs agents antimicrobiens cliniquement utiles, y compris la rifampicine, l’éthambutol, la doxycycline, la minocycline, la TMP-SMZ et la clarithromycine. Deuxièmement, le risque de résistance mutationnelle acquise Le test de susceptibilité de M marinum peut être envisagé pour les patients qui ne répondent pas cliniquement après plusieurs mois de traitement et qui continuent à avoir des résultats de culture positifs. La proportion d’agar, l’élution sur disque d’agar et la microdilution en bouillon ont Cependant, à l’heure actuelle, aucune méthode ne peut être recommandée. Les médicaments suggérés pour le test sont la rifampicine μg / mL, l’éthambutol μg / mL, la clarithromycine μg / mL, en tant qu’agent de classe pour les nouveaux macrolides, amikacine μg / mL et sulfaméthoxazole ou TMP-SMZ μg / mL

Mycobactéries à croissance rapide

Le sous-comité NCCLS recommande la méthode standard de microdilution en bouillon pour le test de susceptibilité du groupe Mycobacterium fortuitum M fortuitum, Mycobacterium peregrinum, et du troisième complexe M fortuitum, Mycobacterium chelonae, et Mycobacterium abscessus La méthode et les lignes directrices pour l’interprétation des résultats devrait s’appliquer à Mycobacterium mucogenicum, au groupe Mycobacterium smegmatis, à M smegmatis, à Mycobacterium goodii et à Mycobacterium wolinskyi, et aux mycobactéries à croissance rapide, pigmentées sur le plan clinique; Le sous-comité NCCLS recommande également que les isolats soient identifiés au niveau de l’espèce ou, à tout le moins, que le groupe M fortuitum soit différencié de M chelonae et M abscessus. Des tests de susceptibilité doivent être effectués pour toute croissance significative sur le plan clinique. les mycobactéries, par exemple, les isolats du sang, les fluides corporels stériles, les tissus et les matériaux prélevés sur les lésions de la peau et des tissus mous. Les mycobactéries à croissance rapide, en particulier M abcessus, peuvent causer une maladie pulmonaire; cependant, ils peuvent également coloniser transitoirement les voies respiratoires Pour cette raison, toutes les mycobactéries à croissance rapide récupérées à partir des expectorations ne sont pas cliniquement significatives vertiges. Les isolements d’expectoration les plus susceptibles d’être de vrais agents pathogènes sont ceux qui répondent aux critères ATS précédemment décrits. Pour répondre à ces critères, par exemple, seules quelques colonies provenant d’un seul spécimen d’expectoration sont plus susceptibles d’être des contaminants ou des colonisateurs et ne justifient donc pas de tests de sensibilité si les résultats de cultures d’échantillons Après un minimum de mois de traitement antimicrobien approprié, les tests de sensibilité doivent être répétés et des tests doivent être effectués pour confirmer l’identité de l’espèce. Les agents antimicrobiens et les concentrations dans des dilutions en série devant être testées contre les mycobactéries à croissance rapide sont l’amikacine – μg / mL, céfoxitine – μg / mL, ciprofloxacine – μg / mL, clarithromycine – μg / mL, doxycycline – μg / mL, imipénem – μg / mL et sulfaméthoxazole ou TMP-SMZ – μg / mL De plus, pour les isolats de M chelonae seulement, la tobramycine – μg / mL devrait être La tobramycine ne doit pas être testée ou au moins les résultats ne doivent pas être rapportés contre des isolats de groupe M fortuitum ou d’abcès M, car, thérapeutiquement, le médicament est supérieur à l’amikacine uniquement pour les infections causées par M chelonae. Les isolats de M chelonae et de M abcessus sont résistants à la CMI sulfaméthoxazole ⩾ μg / mL, alors que tous les groupes M fortuitum sont sensibles Par conséquent, si l’identité de l’espèce est connue ou si, au minimum, M fortuitum différencié de M chelonae et M abscessus, il peut ne pas être nécessaire de tester un sulfamide. En général, les résultats de sensibilité avec les cultivateurs rapides sont disponibles en quelques jours, plutôt que dans un délai de – jours ou même plus pour l ‘autre myco. Les valeurs de CMI des bactéries et une interprétation, qui sont basées sur les points de rupture pour les mycobactéries à croissance rapide énumérées dans le tableau , sont indiquées pour chaque médicament testé, sauf exceptions. la recommandation est basée sur les résultats d’une évaluation multicentrique récente qui a montré que les CMI imipénem pour M chelonae et M abcès qui sont habituellement au point de rupture de la résistance de – μg / mL n’étaient pas reproductibles, entraînant des changements majeurs de la catégorie de susceptibilité [, -] Comme indiqué précédemment, les résultats de tobramycine ne doivent être rapportés que pour M chelonae La tobramycine étant l’aminoglycoside de choix pour les infections à M chelonae , les résultats de l’amikacine ne doivent être rapportés que si l’isolat de M chelonae testé est résistant à la tobramycine

Critères d’interprétation de la microdilution de la souche pour les mycobactéries à croissance rapide Bien que la procédure de microdilution en bouillon pour les mycobactéries à croissance rapide ne soit pas techniquement difficile à réaliser, l’interprétation du MIC n’est pas toujours évidente. expérience avec le test et connaissance des profils de susceptibilité attendus des différentes espèces La croissance des mycobactéries à croissance rapide dans les plateaux de microtitration n’apparaît souvent pas comme un bouton net et bien défini dans le fond du puits, comme cela se produit avec la croissance rapide aérobie. En outre, en bouillon, certaines mycobactéries à croissance rapide ont des extrémités terminales avec certains médicaments, en particulier le M fortuitum et la clarithromycine. Compte tenu de ces difficultés potentielles, les laboratoires qui rencontrent rarement des mycobactéries à le test Etest a été évalué comme une alternative potentielle à la microdilution en bouillon pour les tests de sensibilité des mycobactéries à croissance rapide; cependant, la procédure n’a pas encore été normalisée pour produire des résultats qui correspondent de façon constante à ceux obtenus par microdilution en bouillon . Par conséquent, l’utilisation du test Etest n’est pas recommandée pour tester les mycobactéries à croissance rapide.

Résumé

L’utilisation de méthodes normalisées de test de sensibilité aux mycobactéries est optimale Le premier document NCCLS concernant les tests de susceptibilité antimycobactérienne était une norme provisoire qui traitait uniquement de M tuberculosis La deuxième édition de la norme provisoire du NCCLS est très différente du document initial. MTBC et recommandations proposées pour tester certaines MNT à croissance lente, c.-à-d. MAC, M kansasii et M marinum et le groupe M fortuitum à croissance rapide, M chelonae, et M abcessus Pour la plupart, les recommandations décrites dans le récent document NCCLS qui concernent Les méthodes de test sont basées sur des données publiées, et celles concernant la sélection des médicaments et la fréquence des tests reflètent les opinions actuelles du CDC et de l’ATS. Le document NCCLS ne répond pas à toutes les questions concernant les tests de susceptibilité mycobactérienne, en particulier ceux concernant les méthodes d’essai. la NTM à croissance lente, parce que les données nécessaires tout simplement ne sont pas disponibles Les domaines pour lesquels d’autres recherches sont nécessaires sont clairement indiqués et devraient stimuler d’autres investigations À mesure que de nouvelles données sur les tests de susceptibilité mycobactérienne seront disponibles, ces informations seront intégrées aux futures éditions du document M du NCCLS

Remerciements

Je tiens à remercier les autres auteurs du document NCCLS MT: Barbara Brown-Elliot, Edward P Desmond, Géraldine S Hall, Gaby E Pfyffer, Leonid Heifets, Marianne R Plaunt, John C Ridderhof, Richard J Wallace, Jr, Nancy G Warren , et Frank G Witebsky J’aimerais aussi remercier Shirley Wright, pour son aide au secrétariat